Лада бочка: Купить двухсекционную баню-бочку «Лада» 4 метра под ключ. Описание, цены, фото.

Опубликовано в Разное
/
15 Май 2021

Содержание

Кедровая квадро баня-бочка 4 метра в Екатеринбурге, Челябинске и др.

  • Корпус «Квадро-бочка» собран по технологии «лунный шип-паз», из сибирского кедра камерной сушки (влажность 10-12%). Длина корпуса – 4 м, диаметр – 2,2 м. Количество секций – 2. Размеры секций (комната отдыха / парная): 1,8 / 2 м
  • Ложемент для установки бани – 3 шт.
  • Антисептическая наружная пропитка корпуса и ложементов на основе натуральных масел
  • Стальные нержавеющие саморегулирующиеся стяжки с пружинным замком
  • Крыша вентилируемая из поликарбоната премиум класса Novattro (14 лет гарантии от производителя!). Ширина – 3 м.
  • Дверь накладная (стеклянные вставки, ТПЕ уплотнитель, дверные ручки, магнитный держатель, регулируемые петли) — 2 шт.
  • Форточка с двойным остеклением в парилке – 1 шт.
  • Лавки из сибирского кедра – в комнате отдыха
  • Увеличенные полки из кедра в парилке
  • Столик из кедра в комнате отдыха
  • Напольный трап из кедра – в каждой секции
  • Сливной трап сифонного типа с декоративной решеткой, и выводом 50 мм – в каждой секции
  • Электрооборудование: понижающий трансформатор 12В, светодиодные светильники – 3шт, выключатель, автомат 10А, проводка с защитой
  • Огнезащита печи: стекломагнезитовый лист – 2 шт, минеральная вата, декоративные алюминиевые уголки, усиление алюминиевыми листами. Поддон для печи
  • Печь Термофор Оса + бак для горячей воды самоварного типа из нержавеющей стали
  • Дымоход в сборе из нержавеющей стали (труба, юбка – 2 шт, зонт-дефлектор, кронштейн для крепления трубы, тройник, заглушка с отводом конденсата)

ВНИМАНИЕ! Стоимость доставки и выгрузки, земляные работы, работы по выравниванию площадки, строительство фундамента — это дополнительные услуги, которые НЕ входят в стоимость бани-бочки.

Осуществуем доставку бань-бочек квадро из кедра в любой город.

Комплекты квадро бань-бочек для самостоятельной сборки

Мы производим и отгружаем также конструкторы — комплекты для сборки квадро бань бочек.

  • В виде конструктора для самостоятельной сборки — сэкономьте на строительстве!
  • В разобранном виде для последующей сборкой нашей бригадой на вашем участке.

Доступно 2 варианта конструкторов для сборки квадро бани-бочки: «Под ключ» и «Лайт». Первый включает в себя все, что необходимо для строительства и запуска в эксплуатацию. Второй — только деревянную часть.

Доставка по всей России

Наличие всех лицензий и сертификатов

Никаких посредников! Мы производитель!

Срок изготовления не более 30 дней

Кедровая Квадро БАНЯ БОЧКА «ПАРНА» ЦЕНА

У нас вы найдете квадро бани-бочки «ПАРНА» из кедра по лучшей цене! Многие желающие построить баню, выбирают именно квадро баню-бочку, ведь ее цена значительно ниже. В первую очередь этому способствует то, что под такую баню не нужен фундамент! Баня бочка квадро цена — самый частый вопрос наших клиентов. И нам есть чем гордиться и удивлять! Наша цена на бани бочки из кедра одна из самых низких! Убедитесь в этом сами. 

Можно купить баню-бочку в кредит. Мы работаем с несколькими банками, которые предложат оптимальные условия по кредиту на баню.

Если Вам нужна квадро баня-бочка в Екатеринбурге, Челябинске или Озерске — заказывайте строительство квадро бани бочки «ПАРНА» в «ЕвроДОМ» по телефону: +7(922)704-20-20.

ФСК «ЕвроДОМ»
Тел.: +7(922)704-20-20
 

Лада Гранта — замена охлаждающей жидкости — журнал За рулем

АВТОВАЗ рекомендует заменять жидкость в системе охлаждения Лады Гранта каждые 75 тыс. км пробега автомобиля или через пять лет, в зависимости от того, что наступит раньше.

Заменять охлаждающую жидкость удобнее, когда автомобиль установлен на смотровой канаве или эстакаде.

2279-4-9a-01

Если двигатель горячий, необходимо дать ему остыть, а затем сбросить избыточное давление в системе охлаждения, отвернув крышку расширительного бачка.

Если двигатель горячий, необходимо дать ему остыть, а затем сбросить избыточное давление в системе охлаждения, отвернув крышку расширительного бачка.

Если двигатель горячий, необходимо дать ему остыть, а затем сбросить избыточное давление в системе охлаждения, отвернув крышку расширительного бачка.

Для доступа к сливным отверстиям снизу необходимо снять средний грязезащитный щиток моторного отсека.

Снимооооооооооооооооооок

Грязезащитные щитки моторного отсека автомобиля с МКП и элементы их крепления (вид снизу автомобиля): 1 — три самореза под ключ «на 8» крепления среднего щитка к правому щитку; 2 — правый щиток; 3 — средний щиток; 4 — четыре самореза под ключ «на 8» крепления среднего щитка к нижней поперечине рамки радиатора; 5 — два самореза под ключ «на 8» крепления среднего щитка к левому щитку; 6 — левый щиток; 7 — два болта под ключ «на 10» крепления среднего щитка к лонжеронам кузова

Грязезащитные щитки моторного отсека автомобиля с МКП и элементы их крепления (вид снизу автомобиля): 1 — три самореза под ключ «на 8» крепления среднего щитка к правому щитку; 2 — правый щиток; 3 — средний щиток; 4 — четыре самореза под ключ «на 8» крепления среднего щитка к нижней поперечине рамки радиатора; 5 — два самореза под ключ «на 8» крепления среднего щитка к левому щитку; 6 — левый щиток; 7 — два болта под ключ «на 10» крепления среднего щитка к лонжеронам кузова

Грязезащитные щитки моторного отсека автомобиля с МКП и элементы их крепления (вид снизу автомобиля): 1 — три самореза под ключ «на 8» крепления среднего щитка к правому щитку; 2 — правый щиток; 3 — средний щиток; 4 — четыре самореза под ключ «на 8» крепления среднего щитка к нижней поперечине рамки радиатора; 5 — два самореза под ключ «на 8» крепления среднего щитка к левому щитку; 6 — левый щиток; 7 — два болта под ключ «на 10» крепления среднего щитка к лонжеронам кузова

Отвернув все указанные болты и саморезы, снимаем средний грязезащитный щиток моторного отсека.

Подставляем широкую емкость объемом не менее 6 л под сливное отверстие, выполненное в нижней части правого бачка радиатора. Для снижения интенсивности слива жидкости в первоначальный момент крышку расширительного бачка следует плотно завернуть.

2279-4-9b-01 (Копировать)

Отворачиваем пластмассовую пробку сливного отверстия бачка радиатора…

Отворачиваем пластмассовую пробку сливного отверстия бачка радиатора…

Отворачиваем пластмассовую пробку сливного отверстия бачка радиатора…

2279-4-9b-02 (Копировать)

…и сливаем охлаждающую жидкость в емкость.

…и сливаем охлаждающую жидкость в емкость.

…и сливаем охлаждающую жидкость в емкость.

2279-4-9b-03 (Копировать)

Соединение уплотнено резиновым кольцом.

Соединение уплотнено резиновым кольцом.

Соединение уплотнено резиновым кольцом.

Чтобы слить охлаждающую жидкость из рубашки охлаждения 8-клапанного двигателя, укомплектованного коробкой передач с тяговым приводом, подставляем емкость под сливное отверстие, расположенное на передней стороне блока цилиндров ниже катушки зажигания.

2279-4-9b-04 (Копировать)

Головкой «на 13» отворачиваем пробку сливного отверстия блока цилиндров.

Головкой «на 13» отворачиваем пробку сливного отверстия блока цилиндров.

Головкой «на 13» отворачиваем пробку сливного отверстия блока цилиндров.

2279-4-9b-05 (Копировать)

Сливаем жидкость в емкость.

Сливаем жидкость в емкость.

Сливаем жидкость в емкость.

2279-4-9a-02

На автомобиле с 16-клапанным двигателем, укомплектованным коробкой передач с тросовым приводом, доступу к сливному отверстию в блоке цилиндров препятствует стартер. Кроме того, вытекающая жидкость неизбежно попадет внутрь стартера.

На автомобиле с 16-клапанным двигателем, укомплектованным коробкой передач с тросовым приводом, доступу к сливному отверстию в блоке цилиндров препятствует стартер. Кроме того, вытекающая жидкость неизбежно попадет внутрь стартера.

На автомобиле с 16-клапанным двигателем, укомплектованным коробкой передач с тросовым приводом, доступу к сливному отверстию в блоке цилиндров препятствует стартер. Кроме того, вытекающая жидкость неизбежно попадет внутрь стартера.

Поэтому предстоит снять стартер. Отсоединяем клемму провода от минусового вывода аккумуляторной батареи. Нажав на фиксатор колодки провода, отсоединяем колодку от разъема тягового реле. Снимаем защитный колпачок с гайки крепления наконечника провода, соединенного с плюсовым проводом аккумуляторной батареи.

2279-4-9a-02дж

Накидным ключом «на 13» отворачиваем гайку…

Накидным ключом «на 13» отворачиваем гайку…

Накидным ключом «на 13» отворачиваем гайку…

д

…и снимаем наконечник провода с контактного болта тягового реле.

…и снимаем наконечник провода с контактного болта тягового реле.

…и снимаем наконечник провода с контактного болта тягового реле.

2279-4-9a-01

Накидным ключом «на 13» отворачиваем три болта крепления стартера.

Накидным ключом «на 13» отворачиваем три болта крепления стартера.

Накидным ключом «на 13» отворачиваем три болта крепления стартера.

2279-4-9a-01ж

Снимаем стартер.

Снимаем стартер.

Снимаем стартер.

2279-4-9a-02д

Отворачиваем пробку, как показано выше, и сливаем охлаждающую жидкость из блока цилиндров.

Отворачиваем пробку, как показано выше, и сливаем охлаждающую жидкость из блока цилиндров.

Отворачиваем пробку, как показано выше, и сливаем охлаждающую жидкость из блока цилиндров.

Заворачиваем пробки сливных отверстий радиатора и блока цилиндров. В соединении пробки и блока цилиндров применена коническая резьба, не требующая дополнительного уплотнения. Пробку сливного отверстия блока цилиндров затягиваем моментом 25–30 Н·м. Заливаем жидкость в систему охлаждения двигателя через расширительный бачок до его заполнения. Пускаем двигатель. На работающем двигателе несколько раз поочередно энергично сжимаем все шланги системы охлаждения — это поможет жидкости заполнить систему и вытеснить из нее воздух. По мере падения уровня охлаждающей жидкости в расширительном бачке доводим его до нормы и заворачиваем крышку бачка. При прогреве двигателя отводящий (нижний) шланг радиатора некоторое время должен быть холодным, а затем быстро нагреться, что будет свидетельствовать о начале циркуляции жидкости по большому кругу. Дождавшись включения вентилятора системы охлаждения, останавливаем двигатель. После остывания двигателя еще раз проверяем уровень охлаждающей жидкости и при необходимости пополняем систему.

[14 операций по техобслуживанию Lada Granta, которые помогут вам сэкономить]

[Как сэкономить на плановом ТО Lada Granta] [Техническое обслуживание Lada Granta на 2,5 тыс. км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 15 000 и 105 000 км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 30 000 и 60 000 км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 45 тыс. км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta 75 тыс. км пробега] [Техническое обслуживание Lada Granta на 90 тыс. км пробега] [Самостоятельное проведение ТО — общие рекомендации] [Правила техники безопасности при самостоятельном проведении ТО] [Инструмент, необходимый для проведения техобслуживания Lada Granta] [Лампы, применяемые в автомобиле Lada Granta]

Квадро баня-бочка Лада 4 метра двухсекционная | Сауна, баня в Челябинске — Для дома и дачи на Gde.ru

Квадро-бочка «Лада» — наиболее покупаемая модель из всей
линейки бань «Парна». Благодаря своим небольшим габаритам
баня может уместиться даже на самом небольшом участке.
Почти двухметровая комната отдыха позволяет с комфортом
разместиться семье из четырех-шести человек. Баня «Лада» —
выбор настоящего ценителя русской бани.

Комплектация двухсекционной квадро бани-бочки «Лада» 4 м

Корпус «Квадро-бочка» собран по технологии «лунный
шип-паз», из сибирского кедра камерной сушки (влажность
10-12%).
Длина корпуса – 4 м, диаметр – 2,2 м.
Количество секций – 2.
Размеры секций (комната отдыха / парная): 1,8 / 2 м
Ложемент для установки бани – 3 шт.
Антисептическая наружная пропитка корпуса и ложементов на
основе натуральных масел
Стальные нержавеющие саморегулирующиеся стяжки с пружинным
замком
Крыша вентилируемая из поликарбоната премиум класса
Novattro (14 лет гарантии от производителя!). Ширина – 3 м.
Дверь накладная (стеклянные вставки, ТПЕ уплотнитель,
дверные ручки, магнитный держатель, регулируемые петли) — 2
шт.
Форточка с двойным остеклением в парилке – 1 шт.
Лавки из сибирского кедра – в комнате отдыха
Увеличенные полки из кедра в парилке
Столик из кедра в комнате отдыха
Напольный трап из кедра – в каждой секции
Сливной трап сифонного типа с декоративной решеткой, и
выводом 50 мм – в каждой секции
Электрооборудование: понижающий трансформатор 12В,
светодиодные светильники – 3шт, выключатель, автомат 10А,
проводка с защитой
Огнезащита печи: стекломагнезитовый лист – 2 шт,
минеральная вата, декоративные алюминиевые уголки, усиление
алюминиевыми листами. Поддон для печи
Печь Термофор Оса + бак для горячей воды самоварного типа
из нержавеющей стали
Дымоход в сборе из нержавеющей стали (труба, юбка – 2 шт,
зонт-дефлектор, кронштейн для крепления трубы, тройник,
заглушка с отводом конденсата)

Сравнение Audi 80 B3 и ВАЗ-2110

Экскурс в историю

«Десятку» начали разрабатывать еще в 1983 году, причем изначально автомобиль носил индекс 2112, поскольку обозначение 2110 в то время принадлежало будущей «девяносто девятой». Более того, машина задумывалась как осовремененная классика и потому сохраняла заднеприводную компоновку.

Однако после запуска в производство «восьмого» семейства концепция изменилась, и в 1984-м автомобиль решили перевести на передний привод, сделав акцент на аэродинамике. Платформа при этом, соответственно, сменилась на 2108, которая только-только набирала обороты.

Пройдя через несколько серий прототипов и радикально поменяв концепцию, свой привычный нам облик ВАЗ-2110 приобрел к 1987 году, а к концу десятилетия был готов и интерьер.

Уже «десятка» по обозначению, но не по дизайну: в 1985 году прототип выглядел так

В 1987-м ходовой макет уже был похож на «самого себя». Обратите внимание на оригинальные форточки-«стограммовки» и зеркала, которые крепились к панели двери – в точности так же, как на «бочке».

1 / 3

В 1987-м ходовой макет уже был похож на «самого себя». Обратите внимание на оригинальные форточки-«стограммовки» и зеркала, которые крепились к панели двери – в точности так же, как на «бочке».

2 / 3

В 1987-м ходовой макет уже был похож на «самого себя». Обратите внимание на оригинальные форточки-«стограммовки» и зеркала, которые крепились к панели двери – в точности так же, как на «бочке».

3 / 3

Однако, несмотря на то что предсерийные образцы были пойманы в объектив на полигоне Porsche еще в 1990-м, засветившись потом даже в журнале «За Рулем», плановому запуску автомобиля в июле 1992 года помешал развал СССР. Поэтому увидеть его уже российский обыватель смог только в 1993-м – и то лишь в виде выставочного образца, причем не на Московском автосалоне, а на организованном в Манеже «Логовазом» показе в конце 1992 года.

В 1990 году шпионские фото прототипа опубликовал даже советский журнал «За рулем» Став звездой мартовского номера «За Рулем» в 1993-м, новинка еще долго оставалась выставочным образцом, не воплощаясь в серийный автомобильЭту машину показывали не только публике в Манеже, но и лично Борису Ельцину

Затем еще долгих четыре года машина томилась, пока наконец 27 июня 1995 года в ОПП ВАЗ не были выпущены первые условно-серийные экземпляры. Само же производство началось в августе 1996-го, а продажи стартовали в ноябре того же года. 

На первых машинах дверные рамки красили в черный цвет, что усиливало дизайнерский приём под названием «эффект отрезного колпака» ​

К этому времени назвать «десятку» последним словом техники было уже нельзя, хотя и по дизайну, и по общей компоновке автомобиль на тот момент выглядел вполне современным, причем сам ВАЗ позиционировал эту модель как машину более высокого класса, чем соплатформенная Самара. Впоследствии были освоены универсал с индексом 2111 и пятидверная «двенадцатая». 

Практически в неизменном виде «десятка» продержалась на тольяттинском конвейере до октября 2007 года, а хэтчбек 2112 и «одиннадцатая» выпускались еще год и два соответственно. Сняли с производства десятое семейство по простой причине – весной 2007-го в производство запустили Приору, и внутренняя конкуренция между «рестайлом» и «дорестайлом» одного и того же автомобиля заводу была не нужна. Кроме Тольятти ВАЗ-2110 собирали в украинских Черкассах на заводе корпорации «Богдан» под одноименной маркой, однако из-за известных событий 2014 года поставки машинокомплектов были прекращены, а производство свёрнуто.

Удивительно, но у «десятки» было множество мелкосерийных модификаций – широко известная «Жёлтая Акула», ставшая впоследствии «заряженным» ВАЗ-21106, трехдверный хэтчбек 21123, удлинённый «Консул», полноприводный «Тарзан» и даже гоночная версия, омологированная для участия в чемпионате FIA WTCC, выступившая там в 2008 году

Примерно в то же время, когда «десятка» меняла компоновку на переднеприводную, то есть в 1984 году, в Audi подготовили полноразмерный макет «суперобтекаемого автомобиля» со сверхнизким коэффициентом аэродинамического сопротивления (Сх=0,198), носивший название Audi 80 Cw-Studie Concept. Он был явным предвестником нового поколения «восьмидесятки». 

Предтеча «бочки»: аэродинамичный концепт-кар отличался длинной кормой и… «десяточным» передним бампером! Обратите внимание на плоские колесные арки​

Как в и Тольятти, в Ингольштадте одним выстрелом хотели убить двух зайцев, не только выпустив новую модель, но и подняв её в условной табели о рангах выше прежней «восьмидесятки». По этой причине в компании решили отказаться от общей платформы с Passat, как это было в поколении В2, и создать автомобиль, который бы отличался от аналогичных Volkswagen не только «косметикой».

На заводских эскизах у будущей «бочки» отчетливо просматривается такой же «отрезной колпак», как и на ВАЗ-2110. Совпадение?

За два года автомобиль прошел путь от концепт-кара до серийного образца​

На первых серийных В3 правого наружного зеркала не было!

Упор был сделан на аэродинамику и безопасность, а также на комплектацию. В сентябре 1986-го новая Audi 80 была представлена публике, а уже с 1987-го машину начали выпускать массово, причем Audi в этот момент спешно занималась последними доработками модели и её проверками на полигоне Porsche, где произошла удивительная встреча уже серийной «бочки» с будущей «десяткой». Машины (точнее, «немка» и макет ВАЗ-2110) даже были сфотографированы бок о бок!

Первая встреча макета 2110 и серийного Audi 80 во время аэродинамических испытаний на Porsche​

В то время как в СССР боролись с проблемами и неурядицами, вызванными глобальными геополитическими трансформациями, в ФРГ освоили производство седанов 80 и 90, отличавшихся двигателем и оснащением, а осенью 1988-го к ним присоединилась и «купешка» с незамысловатым названием Coupe. Автомобиль поставлялся и в США, причем только с 2,3-литровым мотором. Жизненный цикл В3 Typ 89 был недолгим: уже в 1991 году эту модель сняли с производства, выпустив в общей сложности за пять лет 1,6 миллиона экземпляров.

Причина отправки на пенсию была ровно той же, что и в случае с ВАЗ-2110: B3 уступила место модели B4 – то есть рестайлинговой версии, отличавшейся от предшественницы примерно так же, как Приора от «десятки». То есть, сохранив прежний кузов, автомобиль осовременили внешне, оснастили подушками безопасности и другими опциями комфорта. Причем увеличенная колёсная база, новая задняя подвеска и другая форма багажника позволяют считать этот автомобиль такой же самостоятельной моделью, как и ВАЗ-2170, который не является «просто модификацией десятки».

Снаружи: обтекаемость прежде всего

На внешность ВАЗ-2110 в своё время оказал влияние дизайн Passat B3, который дизайнер Владимир Ярцев как-то тайно смог рассмотреть на Дмитровском полигоне. Однако в процессе работы акценты сместились, и дизайн «десятки» получился весьма самобытным – в частности, решение с разделением верхней и нижней частей кузова, известное как «эффект отрезного фонаря», на ВАЗе придумали самостоятельно. При всём, казалось бы, очевидном сходстве силуэта с «бочкообразной» формой Audi 80 упрекать тольяттинцев в плагиате нельзя: формы схожи не потому, что Ладу «слизали» с Audi, а просто в угоду аэродинамике – история доказывает, что к идентичным решениям так или иначе приходят многие дизайнеры. 

Найди десять отличий: предлагаем сравнить автомобили в профиль и в три четверти сзади, чтобы убедиться, что они похожи, но всё-таки разные

Вклеенные стёкла (впервые для ВАЗа в частности и легковых советских автомобилей вообще!), заходящие на крышу двери без водосточных желобков, отсутствие резких переходов между объемами, гладкие арки без выступов (как на прототипе Audi!), «леденцовый дизайн» – всем этим ВАЗ-2110 радикально отличался от всех автомобилей советского и российского автопрома. 

У «десятки» коэффициент лобового сопротивления (Сх) чуть хуже, чем у немецкого седана – 0,347 против 0,290 соответственно. Но проблема не столько в плохо проработанной аэродинамике, сколько в больших зазорах и упрощенной по сравнению с прототипами нижней части кузова, а также в большом клиренсе

Вихри враждебные: на некоторых эскизах будущей «десятки» колёса были закрыты не только «глухими» колпаками, но и аэродинамическими щитками!

Теоретически, если бы машина появилась в 1987 году не в виде макета, а как серийный автомобиль, одновременно с «восьмидесяткой», то могла бы оказаться на внешних рынках такой же конкурентоспособной, какой в свое время была «восьмерка». 

Германия, Греция, Франция, Испания, Голландия, Чехия, Венгрия – это далеко не полный список стран, куда ВАЗ-2110, хоть и недолго, но экспортировали

Несмотря на то что новая модель практически сохранила прежнюю колёсную базу (2492 мм), во внешности появилось множество необычных решений. Можно вспомнить и сферические стёкла, и горизонтальный разъем капота по крылу (как на ЗИЛ-130), и вертикальное соединение заднего бампера с крыльями, чего до Ярцева и его команды на советских машинах никто не делал.

Вместе с тем, из-за больших зазоров на товарных машинах всё это в единую картину не соединялось, «рассыпаясь на обломки». Взять, к примеру, заднюю оптику: если её наружные блоки с заходом на крыло располагались горизонтально, то внутренние (на крышке багажника) – уже вертикально. С учётом пресловутых щелей-зазоров визуально единый оптический элемент не образовывался.

Самобытность против традиций: оптика российского и немецкого седанов сгруппирована по-разному. Но уровень стыковки элементов на немецкой машине явно лучше

1 / 4

Самобытность против традиций: оптика российского и немецкого седанов сгруппирована по-разному. Но уровень стыковки элементов на немецкой машине явно лучше

2 / 4

Самобытность против традиций: оптика российского и немецкого седанов сгруппирована по-разному. Но уровень стыковки элементов на немецкой машине явно лучше

3 / 4

Самобытность против традиций: оптика российского и немецкого седанов сгруппирована по-разному. Но уровень стыковки элементов на немецкой машине явно лучше

4 / 4

Не добавляли стремительности и «пухлые» задние крылья с «недорезанными» арками, из-за которых машина смотрелась тяжеловесно и грузно. Как раз из-за этого «десятка» и получила своё прозвище «беременная антилопа». 

Восьмиклапанные версии оснащались маленькими 13-дюймовыми колёсами от Самары. Это сказывалось на внешности машины не лучшим образом

Увы, даже самый стремительный (теоретически) тип кузова хэтчбек 2112 на практике выглядел как тюнинговая модификация Иж-Комби. Ситуацию не спасало даже большое антикрыло (на ранних машинах был спойлер).

На фото: ВАЗ-2112

1 / 3

На фото: ВАЗ-2112

2 / 3

На фото: ВАЗ-2112

3 / 3

Самым сбалансированным, пожалуй, получился универсал 2111, который не портили даже задние арки. Впрочем, «десятка» наверняка смотрелась бы лучше, если бы кузовные зазоры были меньшими раза в полтора и равномерными на всех деталях, а не гуляли от панели к панели и от машины к машине. Хотя спустя 25 лет смотришь на внешность этой машины иначе – она все равно гармоничнее иных современных творений маркетинга с их неправильными пропорциями и «дизайном ради дизайна».

Владимир Ярцев, с которым мы связались при подготовке материала, тоже считает, что на момент разработки дизайн модели был весьма актуальным — против него сыграло время, потраченное на запуск в производство, и некоторые технологические ограничения того времени.

«Если бы мне довелось сегодня разрабатывать дизайн «десятки», то она была бы совершенно другой. Существуют тенденции, которым следуют дизайнеры. Уже когда ВАЗ-2110 продувался на Porsche, резко бросались в глаза несоразмерные с кузовом микроскопические 13-дюймовые диски колес, а в остальном он выглядел даже интересней «бочки», рядом с которой я фотографировал в трубе наш макет. А если бы «десятка» вышла лет на пять раньше, как планировалось с самого начала и качество сборки было получше, да еще сохранили бы двухцветную окраску, которую мы предлагали — автомобиль был бы намного привлекательнее.»

Владимир Ярцев, руководитель дизайн-проекта ВАЗ-2110

Во внешности «бочки» осталось немало идей от обтекаемого прототипа, но зад по понятным причинам стал существенно короче, а применить плоские колёсные арки на «восьмидесятке» не решились, хотя на более «старой» по хронологии Audi 100 C3 они были. После квадратной предшественницы с её плоскопараллельным дизайном внешность В3 была поистине революционной, хотя и её бамперы, и капот, в отличие от «десятки», решены вполне традиционно, да и все светоблоки задних фонарей расположили вертикально.

На обтекаемость кузова работало всё. Даже такая, казалось бы, мелочь, как колёсные колпаки. У большинства «десяток» на штампованных колёсах их не было вовсе

Не был дизайн и тяжеловесным, хотя из-за эффекта «надстройки» верхней части и круглых боковин острословы в начале девяностых тут же метко окрестили эту модель «бочкой». 

Колёсная база седана (2611 мм) на 119 мм превосходила аналогичный показатель «десятки», да и по длине кузова (4580 мм) Audi с её, казалось бы, коротенькой кормой была заметно длиннее российского седана (4265 мм). К слову, именно задняя часть была самой необычной деталью автомобиля, ведь крышка багажника выглядела как небольшой выступ – примерно так же, как на лифтбеках вроде Skoda Octavia первого поколения. Лет тридцать назад такой тип кузова еще называли нотчбэком, но Audi 80 B3 – это стопроцентный трехобъемный седан, где крышка багажника поднималась сама по себе, а заднее стекло было жестко вклеено в проём крыши.

«Подрезанный» задний свес не прошел даром: объем багажного отделения у «бочки» составляет всего лишь 373 литра, в то время как у «десятки» он достигает вполне приличных 450 л. 

После «девяносто девятой» с её высоченным бортом ВАЗ-2110 порадовал поклонников тольяттинских автомобилей меньшей погрузочной высотой и большим проёмом багажника

А еще конструкторам пришлось расположить «запаску» в багажнике вертикально слева, в то время как на российском седане полноразмерное пятое колесо спокойно поместилось в «подполье». Ну а главным недостатком багажного отделения «бочки», кроме неровного пола, был маленький проём, ведь, невзирая на хитрый механизм Г-образной крышки, позволявший ей откидываться в сторону заднего стекла, загрузить сюда какую-то крупную коробку (телевизор, стиральную машину) было просто невозможно.

Эстетика в ущерб практичности: короткая задняя часть и опциональный полный привод сказались и на компоновке, и на объеме багажного отделения не лучшим образом

1 / 3

Эстетика в ущерб практичности: короткая задняя часть и опциональный полный привод сказались и на компоновке, и на объеме багажного отделения не лучшим образом

2 / 3

Эстетика в ущерб практичности: короткая задняя часть и опциональный полный привод сказались и на компоновке, и на объеме багажного отделения не лучшим образом

3 / 3

Внутри: что русскому хорошо, то немцу дорого

Интерьер ВАЗ-2110 не имеет ничего общего с «восьмеркой» визуально, сохранив многие особенности её эргономики. Посадку водителя удалось улучшить за счет регулировки рулевой колонки по наклону, однако сесть удобно за рулём сможет не каждый водитель – кресло широковато, а посадка низковата. При этом рослым «пилотам» на рабочем месте было тесно.

Зато панель приборов с плавными обводами и «стекающей» вниз и немного развёрнутой в сторону консолью выглядела заметно современнее, чем «зубильная», хотя она сохранила общую концепцию с «полочкой» и отдельным блоком комбинации приборов, в то время как на поздних Самарах «торпедо» стало «высоким», то есть консоль словно была продолжением приборов. Забавно, что обрамление «приборки» в виде клавиш можно было встретить как раз на Audi 80 – но не на бочке, а на предшественнице с индексом В2. 

Кнопки по бокам комбинации приборов были на предшественнице «бочки». Случайно ли они появились на «десятке», история умалчивает

«Пухлые» дверные карты также выгодно отличали эту модель от «зубила» – в начале нулевых этот салон воспринимался почти «по-иномарочному»! Конечно, с поправкой на качество отделочных материалов. К слову, у «десятки» они были новыми для отечественных автомобилей – в частности, вудсток и поливуд вместо обычного пластика. Поэтому при разработке салона и оснастки для его производства тольяттинцы обращались к иностранным подрядчикам – итальянцам, японцам и немцам. Но делали детали впоследствии в Сызрани, и это наложило свой отпечаток на восприятие интерьера потребителями.

Зато по комплектации ВАЗ-2110 превосходил не только Самару, но и многие бюджетные европейские модели восьмидесятых годов! Центральный замок, электроприводы передних стёкол (на большинстве машин), бортовая система контроля (БСК), этакий «квазиклимат»-контроль под названием «cистема автоматического управления отопителем» (САУО) с функцией поддержания заданной температуры в салоне – словом, «десятка» уже не была такой «чисто механической», как прежние ВАЗы. 

В качестве довольно редких опций на этой модели можно было встретить гидроусилитель руля и даже кондиционер! Правда, в большинстве случаев «навороты» всё-таки ограничивались электростеклоподъемниками…

Люк в крыше – штатное, хотя и очень редкое оборудование ВАЗ-2110, встречавшееся на ранних машинах

Салон Audi – это «практиш, квадратиш, гут». Дизайнеры выбрали совершенно другую концепцию – «высокая» панель приборов стояла перед водителем и пассажиром словно стена, формируя чувство психологической защищенности. Салон не был ни лёгким, ни воздушным, хотя мощное «торпедо» при этом словно «перетекало» в дверную обивку.​ 

Концепция интерьера была найдена практически сразу же

Еще одна необычная деталь – вертикальные дефлекторы системы вентиляции и отопления, причем на центральной консоли их было целых три. Компоновка приборной панели позволила найти там же место и для аудиосистемы, и для вполне прогрессивных даже по сегодняшним меркам поворотных регуляторов отопителя, а управление «вспомогательными» функциями возложили на крупные прямоугольные кнопки. 

С эргономикой у «бочки» тоже был полный порядок – неудивительно, что именно после этой «восьмидесятки» многие бывшие владельцы Лад приобретали стойкую приверженность к немецкой продукции. 

Удобное кресло, «ухватистый» четырехспицевый руль, а также правильное взаимное расположение педалей, рычага КП и других органов управления позволяли удобно устроиться за рулём обладателю практически любого перцентиля, чего не скажешь про ВАЗ-2110.

Особенность Audi, связанная с формой кузова, – не самая лучшая обзорность

Однако за всё нужно платить – и эта фраза как нельзя лучше отражает подход к оснащению немецкого седана. Прижимистые бюргеры, как правило, заказывали автомобили в комплектации «барабан», а в неё производитель не положил не то что бортовой компьютер или передние стеклоподъемники, но даже «зажал» тахометр! Да-да, в комбинации приборов базовых «бочек» красовались огромные часы – видимо, для того, чтобы обладатель такой машины наблюдал за временем и понимал, что не стоит понапрасну крутить двигатель… 

Огромные часы вместо тахометра на «бочке» – обычное явление​

Шутки шутками, но по комплектации среднестатистическая «восьмидесятка» уступала российской машине, поскольку на «бе-драй» и электроприводы стёкол были редкостью. Конечно, в длинном списке опций было почти всё что угодно, включая кожаный салон и кондиционер, но… что толку, если в реальных автомобилях «навороты» практически никогда не встречались?

Зато из-за более длинной колёсной базы на заднем сиденье «бочки» в сравнении с отечественной машиной было ощутимо больше пространства для ног. Но втроём на втором ряду было всё равно немного тесновато – в первую очередь, в плечах, что объяснялось как раз бочкообразной формой кузова и его сужением в районе боковых стёкол.

Техника: битва концепций

Конструкция ВАЗ-2110 – это классика переднеприводного жанра: поперечное расположение силового агрегата, реечный рулевой механизм, передняя подвеска типа МакФерсон и задняя полузависимая балка.

Из «инноваций» можно вспомнить разве что вентилируемые передние тормоза, впервые появившиеся на автомобилях ВАЗ именно на «десятке». Впрочем, как и «шестнарь»: если ранние экземпляры были оснащены и вовсе карбюраторным полуторалитровым мотором (как на «восемьдесят третьей»), то довольно быстро эту модель полностью перевели на более прогрессивную систему питания, а под капотом модификации 21103 появился полуторалитровый шестнадцатиклапанный мотор с индексом 2112. Он развивал 94 л.с. и 128 Нм, позволяя довольно лёгкой (1010 кг) машине набирать 100 км/ч с места за 12,5 с. За счет хорошей аэродинамики максимальная скорость при этом достигала 180 км/ч – может, и не слишком много по мировым меркам, но так быстро до «десятки» Лады еще не ездили. 

На хорошей дороге стрелку спидометра 16-клапанной версии можно было положить на отметку 200. Реальная же скорость, разумеется, была меньше

В качестве альтернативы предлагался и обычный восьмиклапанный мотор (2111) – с ним машина становилась на секунду и 10 км/ч медленнее, но многие степенные водители ценили восьмиклапанник за покладистость и тяговитость на низких оборотах. 

От восьми до шестнадцати, от Солекса к GM и Bosch: под капотом «десятки» можно было встретить разные моторы, которые базировались всё на том же «ноль восьмом» блоке цилиндров

1 / 3

От восьми до шестнадцати, от Солекса к GM и Bosch: под капотом «десятки» можно было встретить разные моторы, которые базировались всё на том же «ноль восьмом» блоке цилиндров

2 / 3

От восьми до шестнадцати, от Солекса к GM и Bosch: под капотом «десятки» можно было встретить разные моторы, которые базировались всё на том же «ноль восьмом» блоке цилиндров

3 / 3

Вдобавок полуторалитровый «шестнарь» оказался «втыковым», то есть при обрыве ремня ГРМ происходила встреча поршней с клапанами со всеми вытекающими последствиями. Чуть позже оба двигателя прибавили сто кубиков «для храбрости» и стали «безвтыковыми», но максимальная мощность не выросла из-за перехода на более жесткие экологические нормы Евро-3. Что касается трансмиссии, то она на ВАЗ-2110, как и на предшественнице, была безальтернативной – только пятиступенчатая механика с её характерными подвываниями и быстрым выходом синхронизатора второй передачи у тех, кто любил уходить со светофора первым, участвуя в битвах со старыми иномарками.

При всей внешней схожести кузова одного взгляда на подкапотное пространство Audi достаточно, чтобы понять: она другая.

Двигатель вдоль и аккумулятор возле моторного щита – под капотом Audi не имела ничего общего с российской машиной

Продольное расположение силового агрегата, опциональная система полного привода Quattro, автоматическая коробка передач (тоже опция), многорычажная задняя подвеска на полноприводной версии или полузависимая балка с тягой Панара – на переднеприводной, задние дисковые тормоза на мощных модификациях… 

Версию Quattro можно было отличить разве что по шильдику на решетке радиатора. Впрочем, и переднеприводная «восьмидесятка» неплохо ехала даже по снегу, но клиренса «бочке» в наших условиях не хватало

1 / 3

Версию Quattro можно было отличить разве что по шильдику на решетке радиатора. Впрочем, и переднеприводная «восьмидесятка» неплохо ехала даже по снегу, но клиренса «бочке» в наших условиях не хватало

2 / 3

Версию Quattro можно было отличить разве что по шильдику на решетке радиатора. Впрочем, и переднеприводная «восьмидесятка» неплохо ехала даже по снегу, но клиренса «бочке» в наших условиях не хватало

3 / 3

Словом, как раз здесь сумрачный тевтонский гений оторвался по полной. Точнее, максимальное торжество инноваций в рамках модели В3 произошло в области безопасности – ведь на этой модели за 1000 дойчемарок можно было заказать очень необычную систему procon-ten, являвшуюся альтернативой традиционной подушке безопасности. Суть работы этой системы заключалась в том, чтобы в момент фронтального удара с помощью специальной системы натяжных тросов увести рулевую колонку в сторону моторного щита и двигателя. Ремни безопасности при этом натягивались, удерживая водителя и пассажира. 

Свой взгляд на безопасность: система procon-ten решала те же задачи, что и airbag, но совершенно другим путём

1 / 3

Свой взгляд на безопасность: система procon-ten решала те же задачи, что и airbag, но совершенно другим путём

2 / 3

Свой взгляд на безопасность: система procon-ten решала те же задачи, что и airbag, но совершенно другим путём

3 / 3

Таким образом, в Audi не пытались смягчить удар о руль или панель приборов, а хотели вообще избежать контакта людей с деталями интерьера. Однако в 1994-м от сложной системы всё же отказались в пользу традиционных подушек безопасности.

Ну а гамма модификаций двигателей Audi 80 состояла из 17(!) различных версий бензиновых и дизельных моторов! Справедливости ради отметим, что обозначавшиеся парой латинских букв двигатели, по сути, состояли из трёх базовых моторов объемом 1,6 л, 1,8 л, и 2,0 л, а также пары дизелей – атмосферных объемом 1,6 л и 1,9 л, а также двух 1,6-литровых турбодизелей. На вершине моторной линейки был двухлитровый бензиновый шестнадцатиклапанник 6А, выдававший внушительные по тем меркам 137 л.с. и 181 Нм. Он позволял «бочке» не только выезжать из десяти секунд (если быть точным, разгон составлял ровно 9 с), но и перемахнуть двухсоткилометровую отметку (208 км/ч).

«Бочка на шестнаре»: версия 2.0 16V визуально отличалась обвесом и спойлером

Правда, с 1,8-литровым мотором (а чаще всего на В3 встречался именно он) немецкий седан набирал сотню с места за 10,9-13,7 с, то есть не слишком-то быстрее, чем «десятка», причем с карбюраторным мотором объемом 1,6 л «восьмидесятка» была даже медленнее (14,1 с), чем российский седан! Ну а с атмосферным дизелем разгон и вовсе длился целую вечность: заветную «сотку» дизельная «бочка» набирала за бесконечно длинные 20 секунд…

Подавляющее большинство Audi 80B3 были карбюраторными. И ехали ничуть не лучше российского седана

Впрочем, сухие цифры – это одно, ведь динамические качества при старте с места интересны разве что любителям драг-рэйсинга. Как же ехали эти автомобили с точки зрения пресловутого «driving pleasure» – то есть удовольствия от вождения? 

Наша служба и опасна, и трудна: оба автомобиля широко использовались полицией своих стран ​

Пытаясь сделать ВАЗ-2110 комфортнее прежней модели, её подвеску заметно «распустили», а конструкцию кузова в передней части пересмотрели, чтобы снизить уровень вибраций. Как оказалось, за это нужно заплатить «пустым» рулём и невнятным поведением машины в поворотах: несмотря на то что «десятка» тоже побывала на полигоне Porsche, тот самый «геном Порше» новая модель по сравнению с предшественницей потеряла. И если это не сильно печалило обывателя по пути на дачу или работу, то журналисты в своё время высказывали обоснованные претензии в адрес аморфного поведения «антилопы», которая стала ненамного комфортнее, но намного унылее Самары на ходу. 

Вдобавок на машинах первых партий трескались задние стёкла, что тут же породило слухи о недостаточной жесткости кузова и «пластилиновом» передке, у которого гуляют лонжероны, влияя на ощущения водителя не лучшим образом. На практике жесткость кузова на кручение у ВАЗ-2110 лишь чуть ниже, чем у трёхдверной «восьмерки» – 8000 Нм/Град против 8200 Нм/Град. То есть четырехдверный седан десятого семейства заметно опережает по этому параметру как «девятку» (6800 Нм/Град), так и «девяносто девятую» (5500 Нм/Град). В процессе доводки у конструкторов было немало идей по поводу того, как исправить управляемость, сохранив приемлемый уровень комфорта, но из-за не самой удачной экономической ситуации их отложили на потом – как оказалось, не навсегда, а до работ над «рестайлинговой» версией под названием Приора, где эти недостатки и были исправлены хоть в какой-то мере.

Несмотря на то что Audi 80 B3 не стал делить платформу с аналогичным Пассатом, инженерам Audi удалось довести ходовые качества «бочки» до уровня, которого ожидаешь от автомобиля с четырьмя кольцами. Да, машина ехала жестковато, но на высоких скоростях была очень устойчивой, а в поворотах сохраняла нейтральную поворачиваемость, не доставляя водителю особого удовольствия, но и не заставляя его покрываться испариной. Надёжность, предсказуемость, простота – так в трёх словах можно охарактеризовать впечатления от «бе-третьей», не забывая волшебное слово «кваттро». Как писал английский журнал Motor Sport в ноябре 1986 года, во время премьеры модели в Германии дороги поливал дождь, а полноприводная версия 80 quattro относилась к мокрому дорожному полотну с таким презрением, словно оно было сухим.

«Первое, что вы замечаете, когда едете на этой конкретной Audi 80 1,8S, – это отсутствие гидроусилителя руля, который еще был опцией в 1989 году. Он невероятно тяжел на низких скоростях, что делает параллельную парковку сродни силовой тренировке, но на скорости он становится приятно-упругим и позволяет отлично чувствовать автомобиль. Это не машина для водителя как таковая, но в то же время управление этим автомобилем приносит массу приятных эмоций». 

Британское издание «Motoring Research», 5 мая 2016 года​

Вдобавок в салоне ничего не скрипело, а шумоизоляция действительно работала – по крайней мере, если сравнивать с «десяткой». Правда, в полной мере всеми этими положительными качествами могли насладиться лишь первые (немецкие) покупатели или те владельцы «бочек», которые пригнали их с исторической родины еще в девяностые годы. Ведь убитая ходовая никак не способствует тому, чтобы проникнуться результатом работы немецких инженеров-подвесочников, а бессчётное количество разборок салона отнюдь не добавляет тишины. Однако если сравнивать сравнимое, то по устойчивости и управляемости «восьмидесятка» ощутимо превосходит «десятку». Тем более что у немецкой машины были особые версии – том числе, с заниженной и более жесткой подвеской.

Однако с точки зрения практичности на наших дорогах-направлениях ВАЗ-2110 выглядел явно предпочтительнее: 160-180 мм дорожного просвета против скромных 130 мм клиренса у Audi. А ведь этот параметр у нас имеет не меньшее значение, чем породистая управляемость…

Подведём итоги

Было бы наивно думать, что рождавшаяся в перестроечных муках «десятка» сможет превзойти капиталистическую «бочку». Однако российский седан отличался самобытным дизайном с оригинальными решениями, а также практичностью, по которой ВАЗ-2110 мог поспорить с Audi. Ведь вместительный багажник и большой дорожный просвет были по достоинству оценены владельцами старшего поколения, а молодые и горячие автомобилисты ценили «десятку» за боевой характер 16-клапанного мотора и неплохие динамические характеристики автомобиля. Как это ни странно, и комплектация российского седана обычно была чуть богаче, чем у cреднестатистической «бочки» с «веслами» стеклоподъемников вместо кнопочек. 

Впрочем, у потенциального владельца немецкого автомобиля всегда была возможность выбора – как двигателя, так и дополнительного оборудования. Ну а продуманная эргономика, надёжность и высокое качество изготовления были присущи любой версии, и они стали теми факторами, за которые в России и полюбили «бочку». Именно поэтому лет двадцать назад многие после такого же сравнения, как мы сделали в этом материале, предпочитали 10-12-летнюю «восьмидесятку» новенькой «десятке». Такая она, арифметика жизни.

Опрос

Какой из этих автомобилей вызывает у вас больше эмоций?

Всего голосов:

Загородный отель «Истра Holiday» в Подмосковье — официальный сайт

Парк отель Истра Holiday приглашает провести незабываемые выходные, отметить праздники и важные события. Дачный отель расположен в экологически чистом районе Подмосковья, на берегу живописного Истринского водохранилища. Атмосфера этого места располагает к отдыху и веселью. Это место, где можно забыть о проблемах, ежедневной суете. В отеле могут отдохнуть как семьи с детьми, так и компании друзей, влюбленные пары, молодожены. Дачный отель также предоставляет отдельные коттеджи для проведения корпоративов, свадеб, семейных праздников, детских торжеств. На территории отеля находятся рестораны, банкетные залы, бары и лобби.
Загородный отель Истра Холидей предлагает своим гостям комфортабельные домики, номера, разнообразие развлечений и гостеприимство. Истра Холидей – это более 79 номеров на выбор в разной ценовой категории. Вы можете забронировать прямо на сайте номер, отдельный таунхаус или коттедж. Удобно, что на сайте представлены фотографии номеров и апартаментов, подробное описание и цены. Для оформления брони необходимо только заполнить специальную форму в режиме онлайн. Если возникнут вопросы, можно связаться напрямую с менеджерами. Они бесплатно проводят персональные консультации. Воспользоваться предложением могут как корпоративные, так и частные клиенты.
Также дом отдыха Истра Холидей предлагает своим гостям большой выбор развлечений на любой вкус как зимой, так и летом:
● детские комнаты и площадки;
● бильярд;
● караоке;
● тир;
● спортивные площадки;
● мангальные площадки.

Рядом расположено Истринское водохранилище, поэтому можно насладиться рыбалкой, прогулками вдоль живописного берега, купанием. Можно организовать пикник для всей семьи или приготовить сочный шашлык на свежем воздухе. В загородном отеле все продумано для комфортного отдыха на протяжении всего календарного года. Если вы хотите отдохнуть в выходные, отметить праздник или провести время в компании друзей, то оставьте заявку на сайте. Это гарантирует бронь. Приезжайте в выбранное время, чтобы насладиться местным гостеприимством и красивыми пейзажами.

Читать далее свернуть

Основы FRET-микроскопии | Nikon’s MicroscopyU

Считается, что в живых клетках динамические взаимодействия между белками играют ключевую роль в регулировании многих путей передачи сигналов, а также вносят вклад в широкий спектр других критических процессов. В прошлом подходы классической биохимии к выяснению механизма таких взаимодействий были обычным явлением, но слабые или временные взаимодействия, которые могут происходить в естественной клеточной среде, обычно прозрачны для этих методов.Например, совместная локализация предполагаемых белковых партнеров с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках была популярным методом для изучения взаимодействий in situ , и на основе этого метода были представлены многочисленные литературные отчеты. Однако, поскольку разрешение флуоресцентного микроскопа в несколько сотен раз меньше размера типичного белка, совместная локализация часто приводит к сомнительным результатам. Прекрасная аналогия состоит в том, что флуоресцентная микроскопия дает информацию, эквивалентную знанию того, что два студента присутствуют в большом лекционном зале.Он не предлагает разрешения, необходимого для определения того, находятся ли студенты в одном классе или, что еще лучше, сидят ли они за соседними партами.

Рисунок 1 — Фёрстеровский резонансный перенос энергии Яблонски Диаграмма

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на большей длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Мечение клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.При использовании этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, по-видимому, совпадают (и говорят, что совмещают ). Эта очевидная пространственная близость подразумевает, что возможна молекулярная ассоциация. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.

Измерения совместной локализации в лучшем случае наводят на размышления, а в худшем — вводят в заблуждение, особенно с учетом того, что многие сигнальные пути используют одну и ту же клеточную структуру, как, например, покрытые клатрином ямки, которые используются для интернализации многих рецепторных комплексов.Знание о том, что две молекулы или белки на самом деле являются смежными, а не просто находятся в одном и том же соседстве, обеспечивает значительно более надежное определение их потенциала для взаимодействия. Проверенная временем методика электронной микроскопии имеет достаточное разрешение для удовлетворения требований высокоточной локализации, но просто не имеет точной методологии маркировки, необходимой для получения надежных результатов. Кроме того, многие методы совместной локализации обычно применяются для использования в фиксированных клетках, что исключает очень желательные динамические измерения, достижимые с помощью анализов в живых клетках.Визуализация флуоресценции с использованием многоцветных флуоресцентных белков позволяет легко проводить эксперименты с живыми клетками, которые необходимы для анализа переходного взаимодействия, но этот подход страдает от относительно низкого пространственного разрешения, ограниченного примерно 200 нанометрами.

Ограничения в определении пространственной близости белковых молекул можно преодолеть, применив методы микроскопии Фёрстера (или флуоресценции) с резонансным переносом энергии ( FRET ). FRET возникает между двумя правильно расположенными флуорофорами только тогда, когда расстояние между ними составляет от 8 до 10 нанометров или меньше.Таким образом, FRET хорошо подходит для исследования белковых взаимодействий, которые происходят между двумя молекулами, расположенными на расстоянии нескольких нанометров друг от друга. За последние десять лет подходы FRET приобрели популярность из-за роста приложений, требующих генетического нацеливания на определенные белки и пептиды с использованием слияния с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ) и его мутантными производными. FRET между двумя спектрально различными флуоресцентными белками (известный как FP-FRET ) широко применялся для двух совершенно разных экспериментальных методик, как обсуждается ниже.Представлено в Рис. 1 — это энергетическая диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы возбужденного состояния между испусканием донора и поглощением акцептора в FRET. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (синими, зелеными и красными), а колебательная релаксация обозначена волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов.В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано фиолетовой стрелкой на , рис. 1, ). Результирующая флуоресценция , сенсибилизированная, эмиссионная имеет характеристики, аналогичные спектру эмиссии акцептора.

Одним из основных препятствий на пути широкого внедрения исследований FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами.Недавняя разработка флуоресцентных белков, обладающих широким спектром спектральных профилей, и возрастающая сложность белковых химер (гибридных, а также биосенсоров) привели к появлению ряда потенциальных пар флуоресцентных белков, которые можно использовать в экспериментах FRET. Применение флуоресцентных белков к FRET включает либо интеграцию выбранной пары в биосенсор (единая генетически закодированная конструкция), либо проведение межмолекулярных измерений между двумя отдельными белками, каждый из которых слит с другим флуоресцентным белком.Последний подход был использован для визуализации различных белковых взаимодействий, включая олигомеризацию рецепторов и выяснение функций факторов транскрипции. Однако проведение FRET-анализов на независимо экспрессируемых химерных белках намного сложнее из-за изменчивой стехиометрии, которая неизбежно возникает, когда отдельные флуоресцентные объекты экспрессируются в живых клетках. Независимо от сложности, эксперименты такого рода могут дать информативные результаты, если установлены соответствующие элементы управления и исследование проводится с высокой точностью.

Флуоресцентные белковые биосенсоры

Флуоресцентные белковые биосенсоры нашли широкое применение при составлении отчетов о разнообразных внутриклеточных процессах. Благодаря творческому слиянию пар флуоресцентных белков с биополимерами, которые выполняют критически важные функции, связанные с различными аспектами физиологической передачи сигналов, ученые-исследователи разработали множество новых молекулярных зондов, которые можно использовать для оптической визуализации живых клеток таких важных процессов, как индукция кальциевой волны, цикличность. эффекты посланника нуклеотидов, изменения pH, колебания мембранного потенциала, фосфорилирование и действие внутриклеточной протеазы.Альтернативная, но весьма полезная стратегия конструирования биосенсора включает модификации самой структуры основной цепи флуоресцентного белка, либо для разделения пептида на отдельные единицы, которые объединяются in vivo для получения флуоресценции (метод, названный Bi -Molecular F luorescence C oplementation; BiFC ) или для соединения природных амино- и карбоксиконцев вместе и создания сайта встраивания в молекуле для сенсорного пептида.

Первым флуоресцентным белковым биосенсором был индикатор кальция, названный cameleon , сконструированный путем смещения белка кальмодулина и кальций-кальмодулин-связывающего домена киназы легкой цепи миозина (домен M13 ) между усиленными синими и зелеными флуоресцентными белками ( EBFP ). и EGFP ). В присутствии возрастающих уровней внутриклеточного кальция домен M13 связывает пептид кальмодулин, вызывая увеличение FRET между флуоресцентными белками.К сожалению, этому датчику мешал очень низкий динамический диапазон (увеличение флуоресценции в 1,6 раза), и его было трудно визуализировать из-за недостаточной яркости и плохой фотостабильности EBFP. Улучшенные версии с использованием того же шаблона включали голубой и желтый варианты ECFP и EYFP для получения более высоких уровней сигнала, и даже лучшие результаты были получены, когда производные YFP ​​(названные camgaroos ) были получены путем вставки кальций-чувствительных пептидов на начало седьмой цепи beta в остове флуоресцентного белка.Сенсорные пептиды, расположенные в этом необычном положении, довольно хорошо переносятся с точки зрения поддержания высокого уровня флуоресценции. Еще одна стратегия использует преимущества уникальной бочкообразной структуры, характерной для флуоресцентных белков, для изменения конфигурации концов белка путем связывания естественных N и C концов и создания нового стартового кодона в одном из нескольких мест в центральной области строение (обычно в петлях). Эти структурно модифицированные производные, названные циркулярно пермутированными флуоресцентными белками, могут быть слиты с кальмодулином и M13 для получения превосходных биосенсоров кальция.

Рисунок 2 — Флуоресцентный белковый биосенсор FRET для определения протеазной активности

За биосенсорами кальция быстро последовали генетические индикаторы pH, фосфорилирования и протеазной активности. Для адаптации флуоресцентных белков в качестве датчиков pH можно использовать два общих подхода. Первый основан на чувствительности флуоресценции EGFP (pKa = 5,9) и EYFP (pKa = 6,5) к кислой среде в сочетании с относительной нечувствительностью других белков, таких как ECFP (pKa = 4.7) или DsRed (pKa = 4,5). Слияние EGFP или EYFP с менее чувствительным флуоресцентным белком создает логометрический зонд, который можно использовать для измерения кислотности внутриклеточных компартментов. Второй подход основан на изменениях протонирования нативного (дикого типа) GFP, которые приводят к сдвигу бимодальных спектральных профилей нативного белка. Класс зондов под названием pHluorins , производных от wtGFP, демонстрирует сдвиг пика возбуждения с 470 до 410 нанометров при снижении pH.Также были разработаны датчики pH с двойным излучением, у которых есть пики в зеленой и синей областях спектра. Хотя биосенсоры фосфорилирования не могут сообщать об активности киназы в реальном времени, они состоят из пептида, содержащего мотив фосфорилирования из конкретной киназы, и связывающего домена для фосфопептида, зажатого между двумя флуоресцентными белками, способными к FRET. Когда биосенсор фосфорилируется киназой, домен связывания фосфопептида связывается с фосфорилированной последовательностью, таким образом вызывая или разрушая FRET.Доказано, что эта простая стратегия позволяет создавать надежные и высокоспецифичные биосенсоры. Как и у многих других биосенсоров, основным недостатком является уменьшенный динамический диапазон.

Возможно, наиболее широко используемая конструкция биосенсора для скрининга новых или улучшенных пар FRET включает анализ протеазного расщепления (см. , рис. 2, ). Простой мотив состоит из двух флуоресцентных белков, связанных вместе коротким пептидом, который содержит консенсусный сайт расщепления протеазой. В общем, сенсор демонстрирует очень сильную передачу энергии, которая полностью исчезает при расщеплении линкерной последовательности.Поскольку метод обычно имеет высокие уровни динамического диапазона, его можно использовать для скрининга новых голубых и зеленых доноров FRET с желтыми, оранжевыми и красными акцепторами. Самое большое семейство протеазных биосенсоров включает сайт расщепления, чувствительный к одной из протеаз семейства каспаз, что позволяет исследовать датчик во время индукции апоптоза. За последние несколько лет появилось большое количество новых биосенсоров, использующих как сенсибилизированные флуоресцентные белки, так и пары FRET. Несмотря на сохраняющиеся ограничения динамического диапазона датчиков FRET, использующих производные ECFP и EYFP, эта стратегия получила широкое распространение, вероятно, из-за простоты ратиометрических измерений и легкости конструкции датчика.Без сомнения, появятся новые стратегии с использованием более совершенных комбинаций флуоресцентных белков, которые служат для увеличения динамического диапазона и других свойств этого очень полезного класса зондов.

Основные принципы FRET

Фундаментальный механизм FRET включает в себя донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному флуорофору (или хромофору) безызлучательным образом через диполь-дипольные взаимодействия на больших расстояниях.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергетическому обмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных генераторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на той же частоте, или радиоантенна. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем короткодействующий эффект растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Рисунок 3 — Переменные Фёрстера расстояние и коэффициент ориентации в FRET

Феномен FRET не опосредован испусканием фотонов и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и уменьшении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Теория резонансного переноса энергии была первоначально разработана Теодором Фёрстером и недавно была названа его именем в честь его вклада. Теория Фёрстера показывает, что эффективность FRET ( E ) изменяется как обратная шестая степень расстояния между двумя молекулами (обозначается r ):

Формула 1 — Эффективность FRET

E FRET = 1 / [1 + (r / R 0 ) 6 ]

, где R (0) — характеристическое расстояние, при котором эффективность FRET составляет 50 процентов, которое можно рассчитать для любой пары флуоресцентных молекул (эта переменная также называется радиусом Ферстера и более подробно обсуждается ниже).Эффективность FRET теоретической пары флуорофоров (усиленные голубые и желтые флуоресцентные белки) графически продемонстрирована на рис. 3 (а) . Из-за обратной зависимости шестой степени от расстояния между двумя молекулами ( r ) кривая имеет очень резкий спад. Для расстояний менее R (0) эффективность FRET близка к максимальной, тогда как для расстояний более R (0) эффективность быстро приближается к нулю. Полезный диапазон для измерения FRET обозначен красной заштрихованной областью на Рисунок 3 (a) с пределами 0.5 и 1,5 x R (0) . FRET можно эффективно использовать в качестве молекулярной линейки для расстояний, близких к R (0) , и действительно FRET был адаптирован для таких целей в структурной биологии с использованием прецизионных спектроскопических подходов. Однако для большинства приложений в клеточной биологии доступные отношения сигнал / шум ограничивают эксперименты FRET более двоичным считыванием. Фактически, измерение часто может различать только с высоким FRET и с низким FRET или просто между наличием и отсутствием FRET.

Как обсуждалось ранее, R (0) можно легко вычислить для любой пары флуоресцентных молекул. Значение R (0) в водном (или буферном) растворе определяется довольно простым уравнением с хорошо установленными входными параметрами:

Формула 2 — R (0)

R 0 = [2,8 x 10 17 × Κ 2 × Q D D × Дж (λ)] 1/6 нм

, где Κ (2) или в квадрате каппа представляет коэффициент ориентации между двумя флуорофорными диполями (см. Рисунок 3 (b) для сводки углов, используемых для расчета коэффициента ориентации), Q (D) — квантовый выход донора, Ε (A) — максимальный коэффициент экстинкции акцептора в обратных молях на сантиметр, а J (λ) — интеграл спектрального перекрытия (см. {4} dλ $$

Хотя математика может показаться сложной, большинство параметров являются константами, которые легко найти в литературе.Два наиболее важных члена, которые обычно требуют дальнейшего объяснения, — это Κ (2) и J (λ) , интеграл перекрытия. Переменная угла ориентации ( Κ (2) ) просто указывает, что связь FRET зависит от угла между двумя флуорофорами во многом так же, как положение радиоантенны может влиять на ее прием. Если донор и акцептор выровнены параллельно друг другу, эффективность FRET будет выше, чем если бы они были ориентированы перпендикулярно.Эта степень выравнивания определяет Κ (2) . Хотя Κ (2) может варьироваться от нуля до 4, обычно предполагается, что оно равно 2/3, что является средним значением, проинтегрированным по всем возможным углам. Практически для любой реалистичной ситуации 000 (2) близко к 2/3, и обычно исследователь ничего не может сделать, чтобы изменить это значение (хотя некоторые из них жестко прикрепили флуоресцентные белки к интересующим их целевым белкам, что может привести к драматическим эффектам).Интеграл перекрытия, J (λ) , представляет собой область перекрытия между двумя спектрами, как показано на рис. 4 . Другими параметрами, которые могут влиять на FRET, являются квантовый выход донора и коэффициент экстинкции акцептора. Таким образом, чтобы максимизировать сигнал FRET, исследователь должен выбрать донор с наивысшим квантовым выходом, наиболее поглощающий акцептор и флуорофоры, имеющие значительное перекрытие в своих спектральных профилях. Эта теория неоднократно подтверждалась экспериментом, и нет никаких других механизмов для максимизации FRET для невыровненных флуоресцентных зондов.

Рисунок 4 — Интеграл спектрального перекрытия возбуждения и излучения

Следует отметить, что каждый из рассмотренных выше параметров влияет на расчет радиуса Ферстера только в шестой степени. Таким образом, удвоение квантового выхода донора приводит к изменению R (0) только на 12,5%. Поскольку почти все флуорофоры, используемые в экспериментах по визуализации FRET, имеют высокие квантовые выходы (более 0,5) и коэффициенты экстинкции (более 50000), диапазон возможных значений радиуса Ферстера ограничен 4-6 нанометрами, а большинство пар FRET имеют средний значение R (0) ~ 5 нм.Учитывая, что эффективность FRET сильно зависит от расстояния, разделяющего пару FRET, а также от относительной ориентации флуорофоров, FRET можно использовать для обнаружения изменений белок-белковых взаимодействий, возникающих в результате изменений аффинности между двумя белками или изменений в подтверждение их привязки. Стоит повторить, что для большинства приложений визуализации FRET в клеточной биологии эксперименты обычно различают только два состояния (FRET и отсутствие FRET), и необходима дополнительная информация, чтобы помочь в молекулярной интерпретации наблюдаемых изменений FRET.

Факторы, влияющие на измерения FRET

На практике широкий спектр проблем может усложнить и / или поставить под угрозу измерения FRET, что в конечном итоге приведет к неоднозначным или бессмысленным результатам. Одна из основных проблем заключается в том, что донорные и акцепторные флуорофоры могут иметь существенно разные уровни яркости при совместном отображении. Хотя теоретически это несоответствие не должно быть проблемой, однако на практике, поскольку большинство инструментов могут измерять только ограниченный динамический диапазон, визуализация с использованием двойного флуорофора может привести к тому, что один канал будет насыщенным (для более яркого флуорофора), в то время как в другом канале преобладает систематический шум (для диммерного флуорофора).Таким образом, по возможности лучше использовать донор и акцептор сопоставимой яркости.

Еще одним фактором, который может ограничить обнаружение FRET, является стехиометрия донор-акцептор, которая находится вне диапазона от 10: 1 до 1:10. Этот фактор может быть серьезным ограничением в измерениях FRET белок-белковых взаимодействий, в которых один партнер может иметь избыточную концентрацию. Основная проблема — измерение небольшого уровня FRET на фоне флуоресцентных меток, которые не проходят FRET.Из-за того, что в действительности нет ничего, что можно было бы сделать для улучшения этой ситуации, множество возможных экспериментов по взаимодействию белок-белок, попадающих в эту категорию, просто не подходят для исследования методами FRET. Для описанных выше флуоресцентных белковых биосенсоров, которые сконструированы только с одним донором и акцептором, стехиометрия фиксирована и гарантированно составляет 1: 1; таким образом, эта проблема никогда не возникает, и уровень сигнала остается постоянным, независимо от концентрации биосенсора.

Наличие сквозных помех (также называемых перекрестными помехами и кроссоверами ) и перекрестное возбуждение между спектрально перекрывающимися флуорофорами также являются важными проблемами, которые могут затруднить исследования FRET (см. , рис. 5, ). В некоторых случаях акцептор может быть непосредственно возбужден светом в диапазоне длин волн, выбранном для возбуждения донора ( Рисунок 5 (а) ). Кроме того, флуоресценция от донора может просачиваться в канал обнаружения для флуоресценции акцептора, особенно когда спектральные профили излучения донора и акцептора демонстрируют значительное перекрытие ( Рисунок 5 (b) ).Поскольку эти два источника перекрестных помех возникают из-за фотофизики органических флуорофоров и наверняка будут присутствовать для любой пары FRET, их необходимо учитывать при измерении FRET. Выбор флуорофоров, хорошо разделенных спектрально, является отличным механизмом для уменьшения перекрестных помех. Однако в большинстве случаев увеличенное спектральное разделение также уменьшает интеграл перекрытия ( J (λ) ), что на практике обычно приводит к снижению способности обнаруживать сигнал FRET.

Наконец, уровень сигнала FRET может быть уменьшен, если два флуорофора не выровнены должным образом (например, имея значение Κ (2) приблизительно равное нулю) или если они просто не расположены в пределах радиуса Фёрстера. (более 6 нанометров). Например, если два меченых белка взаимодействуют, но флуоресцентные метки расположены на противоположных сторонах комплекса, то может не быть обнаруживаемого сигнала FRET, даже если интересующие белки связаны.В общей практике этот тип ложноотрицательных довольно распространен, особенно с флуоресцентными белками-партнерами FRET. Часто требуется несколько стратегий мечения, прежде чем будет обнаружен достаточный и надежный сигнал FRET. Однако каждую из описанных выше проблем можно смягчить (или частично) путем осознанного выбора пары флуорофоров, которая будет использоваться до создания векторных конструкций или проведения экспериментов по синтетическому мечению.

Рисунок 5 — Спектральное просвечивание (перекрестные помехи) в парах CFP-YFP FRET

Представлено в Рис. 5 — это перекрытие спектральных профилей возбуждения и испускания ECFP и mVenus, в настоящее время одной из наиболее предпочтительных пар флуоресцентных белков для исследований FRET.Эти два белка демонстрируют значительное перекрытие как в спектрах возбуждения (, фиг. 5 (а), ), так и в спектрах излучения (, фиг. 5 (b), ). Прямое возбуждение акцептора FRET (mVenus; красная кривая) может быть значительным в зависимости от длины волны, используемой для возбуждения донора (ECFP; голубая кривая или mCerulean; синяя кривая) из-за более высокого коэффициента экстинкции желтого белка по сравнению с голубые белки. Это перекрытие особенно проблематично, когда ECFP используется в качестве донора и может быть частично компенсировано использованием вариантов CFP с высокими коэффициентами экстинкции, таких как mCerulean.Обратите внимание, что кривые возбуждения на рис. 5 (а) нарисованы в масштабе, чтобы отразить различия в коэффициенте экстинкции между желтым и голубым белками. Возбуждение на 458 нм создает гораздо более высокий уровень перекрестных помех возбуждения в мВенусе, чем при возбуждении на 405 или 440 нм. Широкий спектр излучения флуоресценции ECFP ( Рисунок 5 (b) ) демонстрирует значительное перекрытие интенсивности во всей области излучения mVenus.

Методы FRET в приложениях клеточной биологии

Исследователи, использующие флуоресцентные белковые биосенсоры или пытающиеся сопоставить стехиометрию флуоресцентных зондов, слитых с отдельными взаимодействующими мишенями, должны использовать как можно больше различных методов анализа FRET, чтобы установить методологию для данного эксперимента.Такие усилия оправданы, потому что каждая из пар флуоресцентных белков FRET демонстрирует определенную патологию, которая усложняет ее использование, требуя четкого понимания параметров оптической микроскопии, применяемых для измерения относительно небольших разностей сигналов, возникающих в большинстве анализов FRET. После того, как система и возможные результаты будут хорошо установлены, для текущих процедур можно использовать простейшие подходы. Список методов, разработанных для изображения FRET, довольно обширен.В целом, все существующие стратегии измерения FRET могут быть применены к экспериментам с флуоресцентными белками, но, исходя из практических соображений, пять общих подходов оказались особенно полезными:

  • Сенсибилизированная эмиссия — Двухканальная визуализация с использованием алгоритма, который корректирует перекрестные помехи возбуждения и эмиссии
  • Фотообесцвечивание акцептора — Также известный как декушение донора , этот метод измеряет повышенное излучение донора при фотообесцвечивании акцептора
  • Флуоресцентная микроскопия времени жизни (FLIM) — изменение времени жизни донора флуоресцентного белка (или другого флуорофора)
  • Spectral Imaging — возбуждение на одной или двух длинах волн и измерение полных спектральных профилей донора и акцептора
  • Fluorescence Polarization Imaging — Измеряйте поляризацию параллельно и перпендикулярно возбуждению с высоким отношением сигнал / шум

Каждый из перечисленных выше подходов FRET имеет свои сильные и слабые стороны.Например, с одной стороны, двухканальная визуализация — самый простой метод, но требует наиболее сложного набора элементов управления. С другой стороны, FLIM может дать однозначное измерение эффективности FRET, а инструменты доступны для интеграции в конфокальную систему Nikon A1 HD25 / A1R HD25.

Чувствительное излучение

Также обычно называемый двухцветной визуализацией с элементами управления, сенсибилизированное излучение, возможно, является самым простым методом визуализации FRET. Донорный флуорофор возбуждается определенной длиной волны (в широкоугольном или конфокальном микроскопе), и сигнал собирается с использованием фильтров излучения, выбранных для флуоресценции донора и флуоресценции акцептора.При (нереальном) отсутствии перекрестных помех между возбуждением и флуоресценцией двух флуорофоров сенсибилизированное излучение было бы идеальным методом. Однако перекрестные помехи между флуоресцентными белками представляют собой серьезную проблему, и обычно требуются обширные контрольные эксперименты, чтобы установить наличие или отсутствие FRET. Таким образом, при таком подходе сложно получить количественно точные данные FRET. Сенсибилизированное излучение относительно просто настроить на широкоугольном флуоресцентном микроскопе, доступном во многих лабораториях, но необходимые контрольные эксперименты требуют значительной обработки изображений для вычитания компонентов перекрестных помех, что значительно увеличивает уровень шума и неопределенность измерений.

Для получения изображений с сенсибилизированным эмиссионным FRET разработано множество корректирующих подходов. Основная концепция включает использование различных комбинаций фильтров с несколькими образцами, которые содержат: только донор, только акцептор и предполагаемый образец FRET как с донором, так и с акцептором. Значения излучения из этих выборок позволяют исследователю определить величину ожидаемых перекрестных помех как в каналах возбуждения, так и в каналах излучения и вычесть их из измерения FRET.Теоретически этот подход работает хорошо, но, к сожалению, потребность в обработке изображений увеличивает уровень шума во всех изображениях. Таким образом, если сигнал FRET слабый, тогда может быть трудно измерить FRET с использованием этого подхода.

Рисунок 6 — Фотообесцвечивание сенсибилизированного излучения и акцептора FRET

Несмотря на упомянутые выше трудности, сенсибилизированные измерения излучения могут быть полезны для быстрых динамических экспериментов, в которых сигналы FRET велики из-за возможности одновременного получения обоих изображений.Сенсибилизированное излучение является особенно привлекательным методом при исследовании флуоресцентных белковых биосенсоров, где динамический диапазон FRET велик, а стехиометрия донора и акцептора фиксирована в соотношении 1: 1. Хорошим примером является биосенсор протеазы, показанный на Рисунок 2 . Эта химера была сконструирована так, чтобы иметь высокую эффективность FRET, которая снижается практически до нуля при ферментативном расщеплении пептидного линкера. Результатом является большое и легко поддающееся измерению изменение FRET, которое демонстрирует специфическую протеазную активность в данный момент времени и в определенной области внутри живой клетки.

Акцептор фотообесцвечивания

Несмотря на то, что оно ограничено только одним измерением, фотообесцвечивание акцептора (или ослабление гашения донора) также является простым методом, который часто дает отличные результаты. Основная концепция использует тот факт, что флуоресценция донора гасится во время FRET, потому что часть энергии флуоресценции донора передается акцептору. Фотообесцвечивание акцепторного флуорофора необратимо устраняет эффект тушения и увеличивает уровень флуоресценции донора.Если FRET возникает между флуорофорами, флуоресценция донора должна увеличиваться при удалении акцептора. В общем, важно убедиться, что фотообесцвечивание акцептора не ухудшает флуоресценцию донора и что акцептор фотообесцвечивается примерно до 10 процентов от своего первоначального значения. Оба эти ограничения легко выполняются с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, но также могут быть выполнены с помощью широкоугольных микроскопов или микроскопов с вращающимся диском, оснащенных специальной системой освещения.

Преимущество акцепторного фотообесцвечивания состоит в том, что он очень простой, количественный и выполняется с использованием только одного образца. Эффективность FRET может быть рассчитана путем вычитания интенсивности донора в присутствии акцептора из его интенсивности после фотообесцвечивания акцептора, а затем нормирования этого значения на интенсивность донора после отбеливания. Основным недостатком является то, что фотообесцвечивание акцептора является деструктивным и может использоваться только один раз на ячейку, что ограничивает его применение теми экспериментами, которые не связаны с динамическими измерениями.Кроме того, фотообесцвечивание — относительно медленный процесс, который часто занимает несколько минут или дольше. Тем не менее, почти всегда целесообразно выполнять измерение фотообесцвечивания акцептора в конце эксперимента, независимо от того, какие методы используются для анализа FRET.

Представлено в Рис. 6 являются примерами FRET-тестов сенсибилизированного излучения и фотообесцвечивания акцепторов с использованием изображений живых клеток. На фигуре 6 (a) показана эпителиальная клетка карциномы шейки матки человека (линия HeLa), экспрессирующая биосенсор верблюда, состоящий из mCerulean и mVenus, слитых вместе с промежуточным кальций-чувствительным пептидом, содержащим кальмодулин и домен M13 (описанный выше).Перед добавлением агента, индуцирующего кальций (иономицин), возбуждение клетки с помощью 440-нанометрового освещения вызывает голубую флуоресценцию, указывающую на отсутствие FRET между голубым и желтым флуоресцентными белками ( Рисунок 6 (a) ). После добавления иономицина временная двухцветная визуализация (сенсибилизированная эмиссия) регистрирует кальциевую волну, пересекающую цитоплазму, когда биосенсор реагирует увеличением уровня FRET между флуоресцентными белками ( Рисунки 6 (b) и 6 (c) ) ; FRET — желто-красный псевдоцвет).Клетки почек африканской зеленой мартышки (линия COS-7) на фиг.6 (d) — (f) были помечены синтетическими цианиновыми красителями, Cy3 ( фиг.6 (d), ; зеленый) и Cy5 ( фиг.6). (e) ; красный), конъюгированный с B-субъединицей холерного токсина и нацеленный на плазматическую мембрану. Внутри мембраны непосредственная близость двух красителей обеспечивает высокий уровень FRET. Фотообесцвечивание Cy5 в выбранной области клетки (белый прямоугольник на рис. 6 (е) ) увеличивает декхвенирование донора (усиление зеленой флуоресценции на рис. 6 (е) ) в соответствующей области при просмотре флуоресценции в донорском канале. Только.

Флуоресцентная микроскопия для визуализации на протяжении всей жизни (FLIM)

Измерения срока службы на сегодняшний день являются наиболее строгим методом определения FRET; кроме того, они также менее подвержены артефактам перекрестных помех из-за того, что отслеживается только флуоресценция донора. Все флуоресцентные молекулы демонстрируют экспоненциальное затухание своей флуоресценции в наносекундном масштабе времени, и скорость этого затухания чувствительна к переменным окружающей среде, которые гасят флуоресценцию. Таким образом, основная концепция FLIM отчасти связана с концепцией фотообесцвечивания акцепторов.Флуоресценция донора гасится взаимодействием FRET, и степень гашения может быть определена путем измерения уменьшения времени затухания флуоресценции донора в присутствии FRET. Таким образом, FLIM дает однозначное значение эффективности FRET. Среди преимуществ комбинированных измерений FLIM-FRET — их нечувствительность к артефактам прямого акцепторного возбуждения, а также тот факт, что флуоресцентные доноры могут быть связаны с акцепторами, которые сами не являются флуоресцентными. Оба эти аспекта служат для увеличения числа полезных пар флуоресцентных белков FRET, доступных исследователям.

Рисунок 7 — Приложения FLIM и спектральной визуализации в FRET-микроскопии

FLIM имеет несколько ограничений, которые не позволяют ему быть доминирующим методом в визуализации FRET. В первую очередь, измерения в области наносекундного срока службы являются сложными, а оборудование является дорогостоящим в получении и обслуживании. Кроме того, этот тип сложного оборудования не является широко доступным. Кроме того, FLIM обычно относится к более медленным методологиям построения изображений, потенциально требующим нескольких минут для получения каждого изображения, что ограничивает его полезность во многих экспериментах с FRET.Эти ограничения могут быть сняты в будущем по мере разработки производителями более удобных и быстрых коммерческих систем «под ключ». Другим существенным недостатком является то, что время жизни флуоресцентных белков в живых клетках часто показывает многоэкспоненциальное затухание, что требует более всестороннего анализа данных для количественных анализов FRET. Кроме того, локальные факторы окружающей среды, такие как автофлуоресценция или изменение pH, также могут сократить измеряемое время жизни флуоресценции, что приведет к артефактам.Таким образом, следует проявлять большую осторожность при интерпретации данных FLIM-FRET в живых клетках.

Спектральная визуализация

Метод спектральной визуализации представляет собой разновидность метода обнаружения сенсибилизированного излучения FRET, но вместо сбора данных через два отдельных канала, весь спектр излучения, содержащий как донорную, так и акцепторную флуоресценцию, собирается при возбуждении донора. Запись всего спектра — типичный подход, используемый для спектроскопических экспериментов, но это относительно недавнее дополнение к инструментальной палитре широкопольной и конфокальной микроскопии.Концепция основана на предпосылке, что сбор всего спектра флуоресценции позволяет разделить перекрывающиеся спектры, используя не только пики излучения, но и различные формы спектральных хвостов. Собирая спектр как от донорного, так и от акцепторного флуорофора, можно определить относительные уровни донорной и акцепторной флуоресценции.

Для получения спектральных изображений требуется специальное оборудование, но превосходные системы доступны для многих коммерческих конфокальных микроскопов и могут быть добавлены к обычным флуоресцентным микроскопам по умеренной цене.Проведение количественного анализа уровня перекрестных помех из-за прямого возбуждения акцептора или использования двух длин волн возбуждения в конфокальной микроскопии позволяет точно определить количество FRET. Основным недостатком этого подхода является пониженное отношение сигнал / шум, связанное с получением полного спектра, а не с его сбором по двум каналам с помощью системы на основе фильтров. Однако по мере того, как разрабатываются и устанавливаются все больше коммерческих систем, применение спектральной визуализации в анализах FRET расширяется.В ближайшем будущем вполне возможно, что спектральная визуализация станет одним из основных методов проведения экспериментов по визуализации FRET.

Проиллюстрировано в Рисунок 7 (a) — это изменения в спаде времени жизни донора (флуоресцентный белок mCerulean) псевдо-FRET биосенсора, состоящего из флуоресцентных белков mCerulean и mVenus, слитых вместе с линкером из 10 аминокислот. Синяя кривая спада показывает время жизни, наблюдаемое в клетках, экспрессирующих только mCerulean, тогда как красная кривая спада представляет время жизни mCerulean, полученное, когда клетки экспрессируют конкатенированные белки.Обратите внимание на уменьшение времени жизни mCerulean, когда белок участвует в резонансной передаче энергии. Область между кривыми представляет собой энергию, которая передается через FRET от mCerulean (донор) к mVenus (акцептор) в паре FRET. Профиль эмиссии от 450 до 650 нанометров mCerulean-mVenus в том же псевдобиосенсоре при возбуждении на 405 нанометрах в живых клетках изображен красной кривой на Рис. 7 (b) . Передача энергии от mCerulean к mVenus приводит к значительному пику излучения при 529 нанометрах (максимум излучения mVenus) с гораздо меньшим значением (примерно 25 процентов) на 475 нанометрах, максимальной длине волны излучения mCerulean.После фотообесцвечивания mVenus с помощью 514-нанометрового лазера и повторения спектрального сканирования профиль излучения смещается в сторону более низких длин волн и очень напоминает спектр mCerulean в отсутствие партнера FRET. Разница в интенсивностях на 475 и 529 нанометрах этих спектральных профилей связана с эффективностью FRET между связанными белками.

Построение изображения поляризационной анизотропии

Измерение поляризации флуоресценции дает особые преимущества для высококонтрастной дискриминации флуоресцентного белка FRET.Эта концепция основана на том факте, что при возбуждении поляризованным светом выбирается популяция флуоресцентных молекул, векторы поглощения которых выровнены параллельно вектору поляризации возбуждающего света. Сразу после возбуждения большая часть флуоресцентного излучения будет оставаться поляризованным параллельно возбуждению, так что флуоресценцию можно считать анизотропной с точки зрения поляризации. Анизотропия исчезнет, ​​если молекулы будут вращаться в течение наносекундного времени жизни флуоресценции.Однако, поскольку флуоресцентные белки имеют большие размеры и медленно вращаются, их флуоресценция не деполяризуется в значительной степени во время измерения. Если FRET возникает между двумя флуоресцентными белками, которые слегка смещены, то излучение поляризованной флуоресценции будет появляться под другим углом (от вектора возбуждения), что имитирует вращение флуоресцентного белка.

Рисунок 8 — Получение изображений FRET с поляризационной анизотропией

Основная сила этого подхода — простота измерения поляризации флуоресценции параллельно и перпендикулярно вектору возбуждения с высоким отношением сигнал / шум.Поскольку данные о поляризационной анизотропии могут быть получены быстро и с минимальными требованиями к обработке изображений, этот метод хорошо подходит для приложений при просмотре контента с высоким содержанием. Однако следует избегать прямого возбуждения акцептора, поскольку это может уменьшить донорный сигнал и уменьшить отношение сигнал / шум измерения. Кроме того, хотя этот метод превосходно распознает наличие и отсутствие FRET, он не подходит для различения сильного и слабого FRET.Наконец, поляризация может ухудшаться в объективах с высокой числовой апертурой, поэтому эксперименты с поляризованным FRET следует ограничивать получением изображений с помощью объективов, имеющих числовую апертуру 1,0 или меньше.

Представлено в Рисунок 8 — графическая иллюстрация поляризационной анизотропии с использованием флуоресцентных белков в качестве модельной системы. Когда случайно ориентированная популяция флуоресцентных белков ( Рисунок 8 (a) ) возбуждается линейно поляризованным светом (голубая волна), преимущественно возбуждаются только те молекулы, дипольный вектор поглощения которых ориентирован параллельно азимуту поляризации.Эмиссию правильно ориентированных флуоресцентных белков можно наблюдать как сигнал с помощью анализатора, который также параллелен вектору поляризации возбуждающего света (зеленая волна). Результирующая анизотропия, которая является индикатором степени ориентации, может быть определена путем измерения и сравнения интенсивности излучения с помощью вертикально и горизонтально ориентированных анализаторов. Уровень сигнала анизотропии будет уменьшаться, если флуоресцентный белок вращается в масштабе времени эксперимента ( Рисунок 8 (b) ) или если он передает энергию возбуждения из-за FRET соседнему белку ( Рисунок 8 (c) ), имеющему разная ориентация.Как описано выше, из-за того факта, что резонансная передача энергии может происходить намного быстрее, чем вращение молекул для больших флуоресцентных белковых молекул, деполяризацию из-за FRET можно легко отличить от потери анизотропии, которая происходит во время вращения.

Рекомендации по использованию флуоресцентных белков в FRET

Выбор подходящих зондов для исследования FRET в живых клетках ограничен. Синтетические флуорофоры, идеально подходящие для исследований резонансного переноса энергии в фиксированных клетках, трудно вводить и воздействовать на живые клетки.Точно так же квантовые точки можно использовать для маркировки компонентов мембраны для исследования явлений на внешней стороне клетки, но они тоже не могут проникнуть через мембрану и, следовательно, мало используются во внутриклеточных компартментах, таких как ядро, митохондрии или эндоплазматические клетки. сеточка. Генетически кодируемые флуоресцентные белки в настоящее время представляют собой лучших кандидатов для визуализации FRET в живых клетках с высоким разрешением, о чем свидетельствует объем литературы, публикуемой в этой области ежегодно.Однако многие типичные артефакты, которые встречаются при измерении FRET с помощью синтетических флуорофоров и квантовых точек, особенно остро проявляются при применении к флуоресцентным белкам. Например, в отличие от 30-40 нанометров ширины полосы спектральных профилей излучения в синтетических материалах, профили флуоресцентных белков колеблются от примерно 60 до 100 нанометров, что часто приводит к значительному перекрытию при попытке разделить донорную и акцепторную флуоресценцию. Широкий спектр флуоресцентных белков также ограничивает количество зондов, которые можно использовать вместе в FRET и других типах экспериментов по визуализации.Кроме того, флуоресцентные белки демонстрируют широкий диапазон уровней яркости. Например, один из самых популярных белков-доноров, ECFP, имеет в пять раз меньшую яркость, чем его обычный желтый акцепторный партнер EYFP.

Хромофор флуоресцентного белка окружает полипептид из 220+ аминокислот, намотанный в трехмерную цилиндрическую структуру размером примерно 2,4 на 4,2 нанометра (так называемый бета -ствол или бета -кан ), состоящий из полипептида с обширной водородной связью beta -листов, которые окружают и защищают центральную альфа -спираль, содержащую хромофор (см. Рисунок 9 ).Концы цилиндра закрыты полеспиральными пептидными участками, которые служат для блокирования проникновения ионов и небольших молекул. Внутренняя часть белка настолько плотно упакована боковыми цепями аминокислот и молекулами воды, что остается мало места для диффузии кислорода, ионов или других вторгающихся небольших молекул, которым удается пройти через концы цилиндра. Эти благоприятные структурные параметры, которые частично отвечают за эластичную фотостабильность и отличные характеристики флуоресцентных белков, также способствуют снижению эффективности FRET.Большой размер цилиндра эффективно защищает соседние хромофоры флуоресцентного белка с пептидными остатками (до предельного расстояния близкого приближения от 2 до 3 нанометров; обозначено красной линией на , рис. 9 ), что приводит к снижению максимальной эффективности FRET до примерно 40 процентов от теоретического значения. Тем не менее, многочисленные преимущества использования флуоресцентных белков для FRET-визуализации живых клеток намного перевешивают затраты.

Рисунок 9 — Архитектурные особенности флуоресцентного белка

Высокая степень перекрытия спектральной полосы пропускания и проблемы с размером, которые возникают с флуоресцентными белками, усугубляются их склонностью к олигомеризации.Почти все обнаруженные к настоящему времени флуоресцентные белки демонстрируют, по крайней мере, ограниченную степень четвертичной структуры, о чем свидетельствует слабая тенденция нативного зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria и его производных к димеризации при иммобилизации в высоких концентрациях. Эта тенденция также подтверждается мотивом строгой тетрамеризации природных желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, выделенных у рифовых кораллов и анемонов. Олигомеризация может быть значительной проблемой для многих приложений в клеточной биологии, особенно в тех случаях, когда флуоресцентный белок сливается с белком-хозяином, который нацелен в конкретное субклеточное место.После экспрессии образование димеров и олигомеров более высокого порядка, индуцированное флуоресцентной белковой частью химеры, может вызывать атипичную локализацию, нарушать нормальную функцию, мешать сигнальным каскадам или ограничивать агрегацию продукта слияния внутри конкретной органеллы или цитоплазмы. Этот эффект особенно заметен, когда флуоресцентный белок сливается с партнерами, которые сами участвуют в образовании природного олигомера. Продукты слияния с белками, которые образуют только слабые димеры (фактически, большинство вариантов Aequorea victoria ) могут не проявлять агрегацию или неправильное нацеливание при условии, что локализованная концентрация остается низкой.Однако, когда слабодимерные флуоресцентные белки нацелены на определенные клеточные компартменты, такие как плазматическая мембрана, локализованная концентрация белка в некоторых случаях может стать достаточно высокой, чтобы допустить димеризацию. Это может вызывать особую озабоченность при проведении межмолекулярных экспериментов FRET, которые могут дать сложные наборы данных, которые иногда могут быть скомпрометированы артефактами димеризации. С другой стороны, естественная слабая димеризация в белков Aequorea в некоторых случаях может быть использована для увеличения сигнала FRET в биосенсорах, которые в противном случае демонстрировали бы ограниченный динамический диапазон.

Токсичность — это проблема, которая возникает из-за чрезмерных концентраций синтетических флуорофоров и чрезмерной экспрессии или агрегации плохо локализованных флуоресцентных белков. Кроме того, здоровье и долговечность оптимально меченных клеток млекопитающих в камерах для получения изображений микроскопа также может пострадать от ряда других вредных факторов. Прежде всего, это вызванное светом повреждение (фототоксичность), которое возникает при многократном воздействии на флуоресцентно меченые клетки света от лазеров и дуговых разрядных ламп высокой интенсивности.В возбужденном состоянии флуоресцентные молекулы имеют тенденцию реагировать с молекулярным кислородом с образованием свободных радикалов, которые могут повредить субклеточные компоненты и поставить под угрозу всю клетку. Флуоресцентные белки из-за того, что их флуорофоры скрыты глубоко внутри защитной полипептидной оболочки, обычно не фототоксичны для клеток. При разработке экспериментов FRET следует выбирать комбинации флуоресцентных белков, которые демонстрируют максимально длинные волны возбуждения, чтобы минимизировать повреждение клеток коротковолновым освещением, особенно в долгосрочных экспериментах по визуализации.Таким образом, вместо создания продуктов слияния и биосенсоров с синими или голубыми флуоресцентными белками (возбуждаемыми ультрафиолетовым и синим светом соответственно), варианты, излучающие в желтой, оранжевой и красной областях спектра, были бы гораздо более идеальными.

Исследователи должны позаботиться о проведении необходимых контрольных экспериментов при использовании новых флуоресцентных белковых биосенсоров и клеточных линий, чтобы гарантировать, что артефакты цитотоксичности и фототоксичности не затеняют результаты FRET или другие важные биологические явления.В некоторых случаях липофильные реагенты вызывают вредные эффекты, которые можно спутать с токсичностью флуоресцентных белков во время визуализации клеточных линий после временных трансфекций. Олигомерные флуоресцентные белки (обсуждаемые выше) рифовых кораллов имеют гораздо большую тенденцию к образованию агрегатов (в сочетании с плохой субклеточной локализацией), чем мономерные белки медуз, но неправильно свернутые продукты слияния могут возникать с любым вариантом. Недавно сообщалось, что флуоресцентный белок, способный генерировать активные формы кислорода ( ROS ) при освещении зеленым светом, является эффективным агентом для инактивации специфических белков с помощью хромофорной световой инактивации ( CALI ).Этот генетически закодированный фотосенсибилизатор, получивший соответствующее название KillerRed , способен убивать как бактерии, так и эукариотические клетки при освещении в микроскоп. Предыдущие исследования фототоксичности EGFP показали, что даже благодаря тому, что хромофор способен генерировать синглетный кислород, флуоресцентный белок относительно неэффективен в качестве фотосенсибилизатора. Однако продолжительное освещение клеток, экспрессирующих EGFP и его варианты, может привести к физиологическим изменениям и, в конечном итоге, к гибели клеток, что является определенным сигналом потенциальной фототоксичности в долгосрочных экспериментах по визуализации.

В экспериментах с живыми клетками флуоресцентные белки очень полезны для расширенной визуализации из-за их более низкой скорости фотообесцвечивания по сравнению с синтетическими флуорофорами. Хотя существует высокая степень некоррелированной вариабельности между флуоресцентными белками с точки зрения фотостабильности, большинство вариантов пригодны для краткосрочной визуализации (от 1 до 25 снимков), в то время как некоторые из более фотостабильных белков можно использовать в покадровых последовательностях, которые охватывают периоды продолжительностью 24 часа и более (в которых собираются от сотен до тысяч изображений).Однако долговременная стабильность любого конкретного белка должна быть исследована для каждого сценария освещения (широкопольного, конфокального, многофотонного, качающегося поля и т. Д.), Потому что различия в фотостабильности часто наблюдаются с одним и тем же белком, когда освещение создается дугой. -разрядная лампа в сравнении с лазерной системой. Таким образом, с точки зрения фотостабильности выбор флуоресцентных белков продиктован многочисленными параметрами, включая условия освещения, систему экспрессии и эффективность установки визуализации.

Потенциальный флуоресцентный белок FRET Partners

За последние несколько лет было разработано и доработано большое количество новых вариантов флуоресцентных белков, чтобы иметь профили излучения, охватывающие 200-нанометровый диапазон (примерно от 450 до 650 нанометров), тем самым заполняя множество пробелов, чтобы предоставить потенциально полезных партнеров FRET. во всех цветовых классах. Недавние успехи в разработке белков в синей (от 440 до 470 нанометров) и голубой (от 470 до 500 нанометров) спектральных областях позволили получить несколько новых зондов, которые могут быть полезны для визуализации и исследований FRET.Три группы по разработке белков сообщили об улучшенных вариантах флуоресцентного белка синей Aequorea, которые обладают значительно более высокой яркостью и фотостабильностью по сравнению с EBFP. Названные Azurite , SBFP2 (сильно усиленный синий FP) и EBFP2 (см. Таблицу 1 ), эти белки дают первую реальную надежду на успешную долгосрочную визуализацию живых клеток в синей спектральной области и все они могут применяться в сочетании с EGFP и производными в биосенсорах FRET.Самый яркий и самый фотостабильный из новых синих репортеров, EBFP2, демонстрирует типичное GFP-подобное поведение в слияниях и был продемонстрирован как отличный донор FRET для белков в зеленом спектральном классе. Все синие флуоресцентные белки можно легко визуализировать в флуоресцентном микроскопе с использованием стандартных наборов фильтров DAPI или запатентованных наборов BFP, доступных от производителей послепродажного обслуживания.

Флуоресцентные белки в голубой области спектра широко применялись в качестве доноров FRET в паре с белками, излучающими желтый, и преобладали варианты исходного Aequorea ECFP до появления мономерного репортера бирюзового цвета, известного как мТФП1 .Флуоресцентный белок бирюзового цвета демонстрирует более высокую яркость и кислотную стабильность по сравнению с Aequorea CFP и является гораздо более фотостабильным. Высокий квантовый выход эмиссии mTFP1 (см. , таблица 1, ) обеспечивает отличную альтернативу циановым производным, mECFP и mCerulean, в качестве донора FRET в сочетании с желтыми или оранжевыми флуоресцентными белками. Дополнительные исследования позволили получить полезные белки голубого спектрального класса. Среди недавно представленных улучшенных голубых флуоресцентных белков, CyPet и улучшенный голубой вариант, названный Cerulean , наиболее перспективны в качестве кандидатов на использование тегов слияния, биосенсоров FRET и многоцветной визуализации.Церулеан как минимум в 2 раза ярче, чем ECFP, и в исследованиях FRET было продемонстрировано, что он значительно увеличивает контраст, а также отношение сигнал / шум в сочетании с флуоресцентными белками, излучающими желтый цвет, такими как Венера (см. Ниже). Вариант CFP под названием CyPet (от аббревиатуры: Cy — флуоресцентный белок P для передачи e nergy t ) был получен с помощью уникальной стратегии, использующей сортировку клеток с активацией флуоресценции ( FACS ) для оптимизации голубого и желтая пара для FRET.CyPet примерно вдвое слабее EGFP и на две трети ярче Cerulean, но при 37 градусах Цельсия экспрессирует относительно плохо. Однако CyPet имеет более смещенный в синий цвет и более узкий пик флуоресценции, чем CFP, что значительно увеличивает его потенциал для многоцветной визуализации.

Введение полезных мутаций сворачивания в мономерные варианты ECFP привело к производству новых вариантов с повышенной яркостью, эффективностью сворачивания, растворимостью и характеристиками FRET.Названные super CFP ( SCFP ), новые репортеры значительно ярче, чем родительский белок, когда они экспрессируются в бактериях, и почти в два раза ярче в клетках млекопитающих. Эти высокопроизводительные зонды должны быть полезны как для рутинных тегов слияния, так и для создания новых биосенсоров CFP-YFP FRET, демонстрирующих высокий динамический диапазон. Другой новый мономерный циановый репортер, TagCFP , был получен из GFP-подобного белка медузы Aequorea macrodactyla .Конкретные подробности о белке недоступны в литературе, но он коммерчески доступен в виде векторов для клонирования млекопитающих и слияния от Evrogen. Сообщается, что TagCFP ярче, чем ECFP и Cerulean, но имеет аналогичную кислотостойкость. Другой белок, выделяющий циан, Midoriishi-Cyan (сокращенно MiCy ) был первоначально разработан в качестве донора в новой комбинации FRET с мономерным Kusabira Orange ( mKO ; см. Таблица 1 ) для создания биосенсора. с высоким спектральным перекрытием (расстояние Фёрстера 5.3). Этот белок имеет самые длинные профили длины волны поглощения и излучения (472 и 495 нанометров соответственно), о которых сообщалось для любого зонда в голубой области спектра. Высокий молярный коэффициент экстинкции и квантовый выход, демонстрируемые MiCy, придают белку такую ​​же яркость, что и Cerulean.

Таблица 1 — Свойства выбранных пар флуоресцентных белков FRET 905 905 2 2

На сегодняшний день лучшим выбором для визуализации живых клеток репортеров FRET в классе зеленого цвета (от 500 до 525 нанометров) является производное GFP Emerald , которое имеет свойства, аналогичные его родительскому EGFP. Emerald содержит мутации F64L и S65T , представленные в EGFP, но вариант также имеет четыре дополнительных точечных мутации, которые улучшают сворачивание, экспрессию при 37 градусах Цельсия и яркость.Недавно появилось новое дополнение к зеленой области спектра — суперпапка GFP , которая ярче и устойчивее к кислотам, чем EGFP или Emerald, и имеет аналогичную фотостабильность. Следовательно, вариант суперпапки должен быть отличным кандидатом для слияния с белками млекопитающих и создания биосенсоров FRET, особенно тех, которые демонстрируют проблемы сворачивания со стандартными производными GFP. Другой ярко флуоресцентный репортер, который может быть хорошим кандидатом FRET, называется Azami Green и был выделен из каменистого коралла Galaxeidae и продемонстрировал быстрое созревание во время экспрессии в линиях клеток млекопитающих.Кроме того, сообщалось о двух ярких мономерных репортерах GFP, полученных с помощью сайт-направленного и случайного мутагенеза в сочетании со скринингом библиотеки на циановые белки. Полученный от кораллов рода Clavularia , mWasabi является потенциальной альтернативой FRET-партнеру с зеленым излучением для синих флуоресцентных белков из-за незначительного поглощения при 400 нанометрах и ниже, где часто возбуждаются синие варианты. Новый зеленый репортер коммерчески доступен (Allele Biotechnology) и должен быть особенно полезен для двухцветной визуализации в сочетании с белками с длинным стоксовым сдвигом (такими как T-Sapphire ), а также с тегом локализации в слияниях с целевыми белками.Производное TagCFP, названное TagGFP , представляет собой яркий и мономерный зеленый вариант, имеющий максимум поглощения при 482 нанометрах и излучение при 505 нанометрах. TagGFP, который лишь немного ярче EGFP, доступен в виде векторов клонирования и тегов слияния от Evrogen, но не был полностью охарактеризован в литературных отчетах.

Желтые флуоресцентные белки (от 525 до 555 нанометров) являются одними из самых универсальных генетически закодированных зондов, которые когда-либо были разработаны, и должны предоставить кандидатов, действующих как доноры и акцепторы в парах FRET.Варианты, известные как Citrine и Venus , в настоящее время являются наиболее полезными белками в этом спектральном классе (см. Таблица 1 ), но ни один из них не является коммерчески доступным. Другой вариант, названный в честь камня Topaz , доступен от Invitrogen и был полезен при локализации тегов слияния, внутриклеточной передаче сигналов и исследованиях FRET. Новый член коммерческой серии белков-репортеров локализации Evrogen «Tag», TagYFP , представляет собой производное мономерной медузы ( Aequorea macrodactyla ), которое немного менее яркое, чем EYFP, но на порядок более фотостабильно.Как и его партнеры, TagYFP (пик излучения при 524 нанометрах) не описан в литературе, но может быть приобретен как векторы для клонирования млекопитающих или теги слияния.

Во время того же исследования сортировки клеток с активацией флуоресценции, которое привело к генерации CyPet (обсуждалось выше), также был получен эволюционно оптимизированный комплементарный акцептор FRET, названный YPet . Названный в честь его мастерства в FRET ( Y F P для e nergy t ransfer), YPet является самым ярким желтым вариантом, когда-либо разработанным и демонстрирует приемлемую фотостабильность.Устойчивость к кислой среде, обеспечиваемая YPet, превосходит Venus и другие производные YFP, что увеличивает применимость этого зонда в комбинациях биосенсоров, нацеленных на кислые органеллы. Однако, хотя оптимизированная комбинация CyPet-YPet должна быть предпочтительной отправной точкой при разработке новых биосенсоров FRET, остается серьезное сомнение относительно происхождения повышенной производительности YPet, которая, вероятно, связана просто с усиленной димеризацией с его совместно эволюционировавшими. партнер, CyPet.Аналогичным образом, еще предстоит установить пригодность CyPet и YPet в тегах слияния для экспериментов по локализации, анализа бимолекулярной комплементации и других приложений. Оба белка существуют в растворе в виде слабых димеров, но предположительно могут быть преобразованы в истинные мономеры с использованием мутации A206K, которая так хорошо сработала с другими вариантами Aequorea (хотя это, по-видимому, разрушает их преимущества в FRET).

Оранжевые флуоресцентные белки, все из которых были выделены из видов коралловых рифов, потенциально могут быть полезны в различных сценариях визуализации FRET.Возможно, наиболее универсальным из них является мономерный Kusabira Orange, белок, первоначально полученный в виде тетрамера из грибного коралла Fungia concinna (известного на японском языке как Kusabira-Ishi ). Мономерная версия Kusabira Orange (сокращенно mKO) была создана путем введения более 20 мутаций посредством сайт-направленного и случайного мутагенеза. Мономер (коммерчески доступный от MBL International) проявляет спектральные свойства, аналогичные тетрамеру, и имеет значение яркости, аналогичное EGFP, но немного более чувствительно к кислой среде, чем его родительский компонент.Однако фотостабильность этого репортера является одной из лучших среди белков во всех спектральных классах, что делает mKO отличным выбором для долгосрочных экспериментов по визуализации. Кроме того, спектральный профиль излучения достаточно хорошо отделен от голубых флуоресцентных белков, чтобы повысить эффективность FRET в биосенсорах, включающих mKO, и зонд полезен в многоцветных исследованиях с комбинацией голубых, зеленых, желтых и красных зондов.

Рисунок 10 — Спаривание флуоресцентного белка FRET с дальним красным акцептором

На рисунке 10 показаны спектральные профили ECFP (, рисунок 10 (a), ), EGFP (, рисунок 10 (b), ), EYFP (, рисунок 10 (c), ) и mOrange (, рисунок 10). (d) ), каждый из которых действует как донор FRET для mPlum, акцептора флуоресцентного белка, излучающего дальний красный цвет.Когда спектральные профили излучения доноров смещаются в сторону более длинных волн (от голубого к оранжевому), спектральное перекрытие (закрашенная серая область) и рассчитанное расстояние Ферстера ( R (0) ) соответственно увеличивается. Точно так же перекрестные помехи возбуждения и излучения (красные и синие заштрихованные области соответственно) также увеличиваются по мере уменьшения расстояния между длинами волн между пиками излучения донора и акцептора. Обратите внимание, что ECFP и mPlum демонстрируют лишь ограниченную степень перекрытия в спектрах возбуждения и практически не перекрываются в спектрах излучения.Напротив, когда mOrange сочетается с mPlum, наблюдается высокий уровень перекрестных помех как возбуждения, так и излучения. Поскольку палитра флуоресцентных белков продолжает расширяться, широкий спектр новых пар FRET должен стать легко доступным для исследователей.

Производное mRFP1 , mOrange , немного ярче, чем mKO, но имеет менее 10 процентов фотостабильности, что серьезно затрудняет его применение для экспериментов, требующих повторной визуализации.Однако mOrange остается одним из самых ярких белков в оранжевом спектральном классе и по-прежнему является отличным выбором там, где интенсивность более важна, чем долговременная фотостабильность. Кроме того, в сочетании с T-сапфиром, излучающим зеленый свет, mOrange является подходящей альтернативой белкам CFP-YFP в качестве пары FRET для создания более длинноволновых биосенсоров и может быть соединен с белками в других спектральных областях для многоцветных исследований. Теперь доступна улучшенная версия mOrange (названная mOrange2 ) со значительно увеличенной фотостабильностью.Яркий новый мономерный белок оранжевого цвета, названный TagRFP , был недавно представлен в качестве кандидата на локализацию и исследования FRET и может оказаться эффективным в большом количестве биосенсорных конструкций. Самый яркий флуоресцентный белок в любом спектральном классе — это тандемная версия димера Tomato (dTomato), производного апельсина, который был одним из исходных белков Fruit . Белок томата содержит первые и последние семь аминокислот из GFP на концах N — и C — с целью повышения толерантности к гибридным белкам и уменьшения потенциальных артефактов при локализации, а также повышения возможности его использования. в биосенсорах FRET.Версия тандем-димера (фактически мономер) была создана путем слияния двух копий dTomato «голова к хвосту» с линкером из 23 аминокислот. Благодаря наличию двойных хромофоров полученный tdTomato очень яркий и обладает исключительной фотостабильностью. Основным недостатком использования этого белка является его больший размер (вдвое больше, чем у мономерного белка), который может мешать упаковке слитого белка в некоторых биополимерах.

Поиск идеального флуоресцентного белка, излучающего в красный цвет, долгое время был целью визуализации живых клеток и целых животных с использованием биосенсоров FRET и слияний, в первую очередь из-за потребности в датчиках в этой спектральной области в экспериментах с многоцветной визуализацией, а также того факта, что что более длинные волны возбуждения вызывают меньшую фототоксичность и могут проникать глубже в биологические ткани.На сегодняшний день сообщается о широком спектре потенциально полезных красных зондов (излучение от 590 до 650 нанометров), многие из которых все еще страдают определенной степенью обязательной четвертичной структуры, обусловленной их разновидностями происхождения. В отличие от белков медуз, большинство природных и генетически модифицированных вариантов белков коралловых рифов созревают очень эффективно при 37 градусах Цельсия. Обширные усилия по исследованию мутагенеза, включая недавно внедренную методологию, были успешно применены в поисках вариантов флуоресцентного белка желтого, оранжевого, красного и дальнего красного цвета, которые еще больше снижают склонность этих потенциально эффективных биологических зондов к самоассоциации, одновременно вызывая выбросы. максимумы в сторону более длинных волн.В результате были улучшены мономерные белки с повышенными коэффициентами экстинкции, квантовыми выходами и фотостабильностью, хотя ни один вариант еще не был оптимизирован по всем критериям.

Красные белки mFruit , mApple , mCherry и mStrawberry (пики эмиссии при 592, 610 и 596 нанометрах соответственно) имеют уровни яркости от 50 до 110 процентов EGFP, но mCherry гораздо более фотостабильны, чем mStrawberry, и являются лучшим выбором для замены mRFP1 в долгосрочных экспериментах по визуализации.Дальнейшее расширение спектрального класса белков mFruit за счет итеративной соматической гипермутации привело к появлению двух новых флуоресцентных белков с максимумами длины волны излучения 625 и 649 нанометров, которые представляют собой первые генно-инженерные зонды истинного дальнего красного цвета. Наиболее потенциально полезный зонд в этой паре был назван mPlum , который имеет довольно ограниченное значение яркости (10 процентов от EGFP), но отличную фотостабильность. Этот мономерный зонд должен быть полезен в сочетании с вариантами, излучающими в голубой, зеленой, желтой и оранжевой областях, для экспериментов с многоцветной визуализацией, а также в качестве биосенсора FRET-партнера с зелеными и желтыми белками, такими как изумруд и цитрин (см. , рисунок 10, ). .Несколько дополнительных красных флуоресцентных белков, показывающих различную степень перспективности, были выделены из организмов рифовых кораллов. Применение сайт-специфического и случайного мутагенеза к вариантам TurboRFP с последующим скринингом мутаций, проявляющих дальнюю красную флуоресценцию, привело к димерному белку, названному Катушка (максимум излучения 635 нанометров). Хотя «Катушка» ярче всего на две трети от EGFP, она демонстрирует самые высокие уровни яркости среди всех флуоресцентных белков в спектральном окне, охватывающем от 650 до 800 нанометров, что важно для визуализации глубоких тканей.Введение четырех основных мутаций катушки в TagRFP привело к получению мономерного белка дальнего красного цвета, названного mKate , который имеет сходные спектральные характеристики. Сообщается, что фотостабильность mKate является исключительной, и белок демонстрирует яркость, аналогичную яркости mCherry, что делает его отличным кандидатом для локализации и экспериментов FRET в дальней красной части спектра.

Несмотря на значительные успехи в расширении флуоресцентной цветовой палитры на оранжевую, красную и дальнюю красную области спектра, голубой и желтый Производные Aequorea остаются наиболее полезным сценарием сочетания для разработки полезных биосенсоров.Это непредвиденное несоответствие возникает из-за того, что большинство белков, полученных из оранжевого и красного коралла, демонстрируют относительно широкий спектральный профиль поглощения с длинным хвостом возбуждения, который простирается в фиолетовую и голубую области, таким образом вызывая прямое акцепторное возбуждение. Другой фактор, который может иметь значение, — это относительная скорость созревания слитых флуоресцентных белков-партнеров. В большинстве случаев варианты, полученные из белков Aequorea , созревают гораздо быстрее, чем варианты, полученные из рифовых кораллов, поэтому возможно, что незрелые акцепторы вносят вклад в слабую сенсибилизированную эмиссию, проявляемую многими белками, полученными из кораллов.Кроме того, широкие спектры адсорбции оранжевого и красного белков в сочетании со сниженными квантовыми выходами мономерных версий, вероятно, затрудняют их использование в FRET. Будущий успех экспериментального дизайна флуоресцентного белка FRET будет сосредоточен, среди прочего, на согласовании скоростей созревания парных белков.

Выводы

Хотя эксперименты с FRET, основанные на вездесущем семействе флуоресцентных белков, предлагают огромный потенциал для выявления молекулярной динамики в живых клеточных системах, идеальной пары FRET пока нет.Оптимизированные версии CFP и YFP по-прежнему обеспечивают наиболее эффективную пару для общего использования, хотя лучшие комбинации могут появиться на горизонте. Точно так же не существует идеальной техники для измерения FRET, хотя все описанные выше подходы имеют сильные стороны, которые можно использовать в зависимости от конкретной исследуемой экспериментальной ситуации. По мере того, как становятся доступными более оптимизированные флуоресцентные белки, включая ярко-красные варианты, которые могут быть подходящими в качестве акцепторов для доноров GFP или YFP, FRET, использующий флуоресцентные белки, должен стать еще более полезным для исследований межбелкового взаимодействия в живых клетках.Как обсуждалось, широкие спектры поглощения текущей палитры красных флуоресцентных белков, в дополнение к более низким квантовым выходам мономерных версий, затрудняют использование этих кандидатов в FRET. Тем не менее, быстрые темпы усовершенствования флуоресцентных белков вселяют оптимизм в отношении того, что такие белки будут доступны в ближайшем будущем, и помогут произвести дальнейшую революцию в этом новом подходе к выяснению внутриклеточных биохимических механизмов.

700514-5226aa Стул бочонка мебели A R T с работой лада

Информация для 700514-5226aa
Белковая пара Максимум возбуждения донора
(нм)
Максимум эмиссии акцептора
(нм)
Квантовый выход донора Коэффициент молярной экстинкции акцептора Яркость фёрстера
EBFP2-mEGFP 383 507 0.56 57,500 4,8 1: 2
ECFP-EYFP 440 527 0,40 83,400 4,9 1: 4 9040u 528 0,62 92,200 5,4 1: 2
MiCy-mKO 472 559 0,90 51,600 492 528 0.85 92,200 5,1 1: 1
CyPet-YPet 477 530 0,51 104,000 5,1 1: 4,5 610 0.60 72,000 5,1 2,5: 1
Venus-mCherry 528 610 0,57 72,000 528 581 0.57 138,000 5,9 1: 2
Venus-mPlum 528 649 0,57 41,000 5,2 13: 1 13: 1
Размер: 31.0 Ш x 30,0 В x 30,0 Г
Вес:

75,0 фунтов

Кубики: 24,6 куб. Футов
Комната: Мебель для гостиной
Категория: Стулья для гостиной
Morgan Rose by A R T Furniture

Открытых деревянных деталей из коллекции премиальной обивки Morgan Rose достаточно, чтобы остановить любого. Именно то, что вы хотите сделать центром внимания в декоре вашей гостиной.Сиденья из смесового пуха обеспечивают роскошный комфорт в каждой детали.
Некоторые из особенностей, которые отличают коллекцию Morgan Rose от A R T Furniture:
  • Каркасные конструкции из твердых пород дерева и ламината.
  • Конструкция из углового блока: тройной прочности, скрепленная скобами или привинченная к прилегающей рамке.
  • Подушка сиденья из смесового пуха с канавками для предотвращения смещения материала из смесового пуха.
  • Подушка многоместного сиденья, наполненная пуховой смесью, является двусторонней для увеличения срока службы
  • Открытый деревянный рычаг
  • Тафтинговая спинка
  • Выкройка из однотонной ткани
  • переходный стиль
  • Роза
Основанная в 2003 году, компания A R T Furniture привносит в свой дизайн страсть и качество.Их изысканный ассортимент коллекций спальни, столовой и случайной мебели прекрасно дополнит ваш дом. Каждый предмет мебели тщательно продуман, чтобы гарантировать качество и единообразие. Элегантная и стильная мебель от A R T Furniture объединяет некоторые общие черты, такие как нанесение превосходных твердых материалов и эффектного шпона, а также потрясающий дизайн ручной работы. Компания A R T Furniture стремится постоянно предлагать инновационный дизайн, высочайшее качество изготовления и функциональность всех предметов мебели.

Многие предметы в коллекциях мебели для спален и столовых украшены бархатными вкладышами для украшений. Большинство развлекательных предметов и шкафов имеют электрические розетки для подключения любого типа электроники. A R T Furniture предлагает свежие коллекции и безупречное качество строительства.

Обзоры 700514-5226aa

Этот продукт еще не получил оценок. Щелкните здесь, чтобы просмотреть этот товар первым.

Искажение бислоя и динамика комплекса БАМ в липидных нанодисках

Получение БАМ на липидных нанодисках

Приготовление комплекса БАМ, растворенного детергентом, и мутантов цистеина: интактный комплекс БАМ (BamABCDE) или БАМ (R127C / N520) C690S / C700S) BCDE экспрессировали и очищали, как описано ранее, адаптировано из Roman-Hernandez et al. 66 . E. coli BL21 (DE3) трансформировали плазмидой pJh214, содержащей BamA-E с C-концевой меткой His 6 на BamE. Клетки выращивали в бульоне 2 × TY (37 ° C, 200 об / мин) до OD 600 ~ 0,6 и экспрессию белка индуцировали 0,4 мМ IPTG. Через 1,5 часа экспрессии клетки собирали центрифугированием в роторе Beckman JLA-8.1000 (4000 об / мин, 15 мин, 4 ° C), осадок ресуспендировали в 20 мМ трис-HCl, pH 8, лизировали с помощью дезинтегратора клеток (постоянная Cell Disruption Systems, UK), затем центрифугировали (6000 г , 10 мин, 4 ° C) для удаления остатков клеток.Клеточные мембраны выделяли ультрацентрифугированием в роторе 50.2Ti (45000 об / мин, 30 мин, 4 ° C). Затем осажденные мембраны инкубировали при 4 ° C в течение 2 ч с 10 мл / л холодного 50 мМ трис-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl (TBS), 1% (мас. / Об.) DDM и повторяли ультрацентрифугирование для удаления нерастворимых веществ. материал. Комплекс BAM был выделен Ni-аффинной хроматографией с использованием гранул Ni-NTA агарозы и очищен эксклюзионной хроматографией (SEC) на колонке Superdex 200, 10/300 GL в TBS, pH 8,0 с 0,05% (мас. / Об.) DDM. как описано ранее 15 .

Получение MSP1D1 и MSP1E3D1: MSP1D1 67 и MSP1E3D1 68 получали, как описано ранее 69 . Клетки E. coli BL21 (DE3) трансформировали вектором pET-28a (+), содержащим вставку MSP с меткой His. Отдельные колонии использовали для инокуляции 100 мл заквасок (LB с 50 мкг / мл канамицина). После роста в течение ночи (37 ° C, 200 об / мин) заквасочные культуры разбавляли 1 л LB (1 из 100 разведения), содержащего канамицин (50 мкг / мл).Клетки выращивали (37 ° C, 200 об / мин) до OD 600 ~ 0,6 и экспрессию белка индуцировали 1 мМ IPTG. Через 3 ч клетки собирали центрифугированием, ресуспендировали в 20 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 1 мМ PMSF (15 мл / л культуры) и дезоксирибонуклеазу I (5 мг) и Triton X-100 (1% ( об. / об.)). Клетки гомогенизировали и лизировали обработкой ультразвуком (взрывы 6 раз по 1 мин с охлаждением на льду в течение 1 мин между каждым всплеском). Лизат центрифугировали (30 000 г , 10 мин, 4 ° C) и супернатант наносили на колонку HisTrap FF (5 мл, GE Healthcare), уравновешенную 20 мМ натрий-фосфатным буфером, pH 7.4. Колонку промывали ~ 100 мл каждого из буфера 1 (40 мМ трис-HCl, 0,3 М NaCl и 1% (об. / Об.) Тритон X-100, pH 8,0), буфера 2 (40 мМ трис-HCl, 0,3 М NaCl, 50 мМ холат натрия и 20 мМ имидазол, pH 8,0) и буфер 3 (40 мМ Трис-HCl, 0,3 М NaCl и 50 мМ имидазол, pH 8,0) перед элюированием MSP1D1 или MSP1E3D1 25 мл 40 мМ Трис. -HCl, 0,3 М NaCl и 0,4 М имидазол. Для нанодисков, используемых в анализах активности BAM, метку His расщепляли добавлением протеазы TEV (1 мг TEV на 18 мг MSP) в TBS, pH 8.0,14,3 мМ β-ME в течение 24 ч при 4 ° C. Расщепленную метку His и протеазу TEV удаляли на колонке HisTrap FF объемом 5 мл перед ночным диализом против TBS, pH 8,0 при 4 ° C. Очищенный MSP1D1 или MSP1E3D1 диализовали против 20 мМ Трис-HCl, 0,1 М NaCl и 0,5 мМ ЭДТА, pH 7,4, в течение ночи при 4 ° C, а затем концентрировали, фильтровали и мгновенно замораживали в жидкости N 2 для хранения при — 80 ° С.

Сборка БАМ-содержащих нанодисков: Полярный липидный экстракт E. coli (Avanti Polar Lipids, Алабастр, Алабастр, США) растворяли при 25 мМ в 100 мМ холате натрия в TBS при pH 7.0. Для нанодисков BAM, солюбилизированный DDM BAM, MSP и солюбилизированный полярный липидный экстракт E. coli были объединены в соотношениях 1: 3: 60 и 1: 3: 180 (моль / моль / моль) для MSP1D1 и MSP1E3D1, соответственно. . Для пустых нанодисков соотношение MSP и полярного липидного экстракта E. coli составляло 1:35 и 1:75 (моль / моль) для MSP1D1 и MSP1E3D1, соответственно. Конечная концентрация холата натрия в восстанавливающей смеси составляла 14 мМ. Чтобы удалить детергент и способствовать образованию нанодисков, смесь инкубировали с BioBeads (SM-2 (BioRad)) в течение 24 часов при 4 ° C, при этом BioBeads заменяли всего 4 раза.Для BAM в расщепленных His-меченых MSP1D1 или MSP1E3D1, используемых в анализах активности, BAM-содержащие нанодиски иммобилизовали на агарозе Ni-NTA для удаления любых пустых нанодисков. После элюирования в TBS, pH 8,0, 500 мМ имидазола, 5% (об. / Об.) Глицерин BAM-содержащие нанодиски диализовали против TBS, pH 8,0, в течение ночи при 4 ° C в 500 мкл диализа Slide-A-Lyzer TM . картриджи MWCO 20 k (Thermo Scientific). Присутствие всех пяти субъединиц BAM в нанодисках было подтверждено с помощью SDS-PAGE (дополнительный рис.1).

Анализы активности BAM

Приготовление липосом: BAM-солюбилизированный DDM восстанавливали в протеолипосомы, как описано ранее 15 , с использованием процедуры, модифицированной из Thoma et al. 70 . DDM-солюбилизированные BAM и E. coli полярные липидные пленки, солюбилизированные в TBS с 0,05% (мас. / Об.) DDM, смешивали при соотношении липидов к белку 2: 1 (мас. / Мас.) И диализовали против буфера без детергента ( 20 мМ трис-HCl, pH 8,0, 150 мМ KCl и 0,01% (мас. / Об.) Азида натрия (диализный буфер)) при 21 ° C в течение 2 дней, всего четыре смены буфера.Протеолипосомы осаждали ультрацентрифугированием (100000 г , 30 мин, 4 ° C) и ресуспендировали в TBS, pH 8. Этап ультрацентрифугирования повторяли перед окончательным ресуспендированием в TBS, pH 8 и количественным определением с использованием анализа BCA (Thermo Scientific ).

Экспрессия и очистка SurA: SurA с N-концевой меткой 6 × His и сайтом расщепления TEV экспрессировали и очищали с использованием протокола, адаптированного из Burmann et al. 71 . SurA экспрессировался в клетках E. coli BL21 (DE3), которые лизировали с помощью разрушителя клеток, и дебрис удаляли центрифугированием.SurA в осветленном лизате иммобилизовали на 5-миллилитровой колонке HisTrap FF (GE Healthcare), денатурировали и промыли на колонке 25 мМ трис-HCl, 6 М гуанидин-HCl, pH 7,2, повторно свернули на колонке промыванием 25 мМ трис-HCl, pH 7,2, 150 мМ NaCl и 20 мМ имидазол, элюируется 25 мМ трис-HCl, pH 7,2, 150 мМ NaCl и 500 мМ имидазолом. Элюированный SurA диализовали против TBS, pH 8,0, в течение ночи при 4 ° C. Метку His расщепляли добавлением 14,3 мМ 2-меркаптоэтанола и меченной His протеазы TEV, полученной, как описано ранее 29 .После инкубации в течение ~ 18 ч при 4 ° C расщепленную метку His и протеазу TEV удаляли на колонке HisTrap FF объемом 5 мл. Очищенный SurA диализовали против 5 л TBS, pH 8,0, концентрировали до ~ 200 мкМ с использованием концентраторов Vivaspin 20 MWCO 10 кДа (Sartorius, UK), разделяли на аликвоты, мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C.

Экспрессия и очистка OmpT и Cys-tOmpA: OmpT и tOmpA были экспрессированы в виде телец включения в клетках E. coli BL21 (DE3) с использованием процедуры, модифицированной из McMorran et al. 55 N-концевой остаток Cys вводили в tOmpA с использованием сайт-направленного мутагенеза Q5 (NEB). Клетки выделяли центрифугированием, лизировали обработкой ультразвуком и нерастворимый материал выделяли центрифугированием. Нерастворимую фракцию ресуспендировали в 50 мМ трис-HCl, pH 8,0, 2% (об. / Об.) Triton X-100, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре (~ 23 ° C) при осторожном перемешивании. Нерастворимые тельца включения осаждали и дважды промывали ресуспендированием в 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при осторожном перемешивании.Затем тельца включения солюбилизировали в 25 мМ трис-HCl, 6 М гуанидин-HCl, pH 8,0 и центрифугировали (20000 г , 20 мин, 4 ° C). Супернатант фильтровали с помощью шприцевого фильтра из поливинилдифторида (PVDF) с размером пор 0,2 мкм (Sartorius, UK) и очищали с помощью SEC, используя колонку Superdex 75 HiLoad 26/60 (GE Healthcare), уравновешенную 25 мМ трис-HCl, 6 M гуанидин- HCl, pH 8,0. Очищенный белок концентрировали до> 200 мкМ с использованием концентраторов Vivaspin 20 (5 кДа MWCO) (Sartorius, UK), мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C.Для экспериментов по сворачиванию OmpT и tOmpA заменяли буфером на TBS, pH 8,0, 8 М мочевину с использованием спиновых обессоливающих колонок Zeba , 7 k MWCO, 0,5 мл (Thermo Scientific).

Мечение Cys-tOmpA с помощью Alexa Fluor 488: очищенный Cys-tOmpA при 200 мкМ в 25 мМ трис-HCl, 6 M гуанидин-HCl (Gdn-HCl), pH 7,2, восстанавливали инкубацией с 10 мМ DTT при 4 ° C в течение 30 мин. Белок заменяли буфером на 25 мМ трис-HCl, 6 М Gdn-HCl, pH 7,2 (барботировали в течение 15 минут газообразный азот) с использованием спиновых обессоливающих колонок Zeba (Thermo-Fisher Scientific, Великобритания).Немедленно добавляли малеимид Alexa Fluor 488 C5 (Thermo-Fisher Scientific, Великобритания) (10 мг / мл, растворенный в диметилсульфоксиде) до конечной концентрации 2 мМ. Общий объем пробы составил 480 мкл. Реакцию мечения инкубировали при 25 ° C в течение 1 ч, затем оставляли на ночь при 4 ° C. Свободный краситель удаляли с помощью SEC на колонке Superdex Peptide 10/300, уравновешенной 6 M Gdn-HCl, 25 мМ Tris-HCl, pH 7,2. Фракции собирали каждые 1 мл и фракции пикового белка тестировали на мечение красителя с использованием Nanodrop 2000 (Thermo-Fisher Scientific, Великобритания), мгновенно замораживали с использованием жидкого азота и хранили при -80 ° C.

Анализы укладки tOmpA со сдвигом полосы в липосомах и нанодисках: Растворы 5 мкМ меченного Alexa Fluor 488 Cys-tOmpA, денатурированного в TBS, содержащем 8 M мочевины, разбавляли в 5 раз в 10 мкМ растворе SurA. Затем эту смесь немедленно разбавляли в 2 раза на BAM-содержащих нанодисках или протеолипосомах для инициации фолдинга. Контрольный образец без нанодисков был приготовлен путем разбавления этой смеси в TBS, pH 8,0. Конечные реакционные концентрации составляли 0,5 мкМ Alexa Fluor 488-Cys-tOmpA, 5 мкМ SurA и 0.Нанодиски / протеолипосомы БАМ 5 мкМ в TBS, pH 8,0, 0,8 М мочевина. После сворачивания в течение 16 ч при 25 ° C реакцию гасили добавлением 4 × SDS-PAGE загрузочного буфера, и образцы загружали в 15% (мас. / Об.) Гели Tris-Tricine SDS-PAGE. Гели были визуализированы с использованием гелевой документации Alliance Q9 Advanced (UVITEC, Кембридж, Великобритания) в режиме флуоресценции при свете 460 нм.

Анализы активности сворачивания OmpT в липосомах и нанодисках: активность BAM контролировали по расщеплению флуорогенного субстрата с помощью свернутого и вставленного OmpT, как выполнялось ранее 15 .Раствор 1 мкМ OmpT и 10 мкМ SurA в TBS, pH 8,0, содержащий 1,6 М мочевины, разводили в два раза в протеолипосомах, содержащих БАМ, или в растворе нанодисков, содержащих БАМ, в TBS, pH 8,0, содержащем 2 мМ фторопептида Abz – Ala. –Arg – Arg – Ala – Tyr (NO 2 ) –NH 2 (синтетические пептиды). Реакции только с OmpT-SurA и только с фторпептидом проводили без соответствующих белков. Конечными условиями реакции были 0,5 мкМ БАМ, 0,5 мкМ OmpT, 5 мкМ SurA, 1 мМ фторопептид, TBS, pH 8.0 и 0,8 М мочевины. Флуоресценцию расщепленного пептида контролировали при 430 нм после возбуждения при 325 нм каждые 20 с в течение 5,5 ч при 25 ° C с использованием планшет-ридера Clariostar (BMG Labtech GmbH). Все анализы проводили в трех экземплярах в конечном реакционном объеме 50 мкл, и из всех измерений вычитали пустой буфер.

Электронная микроскопия

Подготовка крио-ЭМ сетки: В целом медные электромагнитные сетки размером 300 меш, несущие углеродную пленку с отверстиями R2 / 1 Quantifoil (EM Sciences), подвергали тлеющему разряду в течение 60 с при 10 мА в установке для нанесения покрытий Cressington 208. (Cressington Scientific Instruments).Всего было нанесено 4 мкл образца BAM-нанодиска 5 мкМ, решетки промокнули фильтровальной бумагой Whatman # 1 перед стеклованием в жидком этане с использованием погружного морозильника Leica EM-GP (Leica Biosystems GmbH).

Крио-ЭМ визуализация: в общей сложности 15 504 микрофотографии были записаны с двух сеток в течение четырех сеансов с использованием ЭМ Titan Krios (Thermo-Fisher), работающего при 300 кэВ. Изображения были записаны на детекторе K2 с энергетической фильтрацией (Gatan Inc.) при номинальном увеличении 130000 ×, что дает размер пикселя 1.065 Å. Общая доза колебалась от 35,1 до 50,3 e / Å 2 по четырем наборам данных. Изображения были записаны как серия из 20 или 40 кадров, что дало покадровые дозы 1,0–1,8 e / Å 2 . Параметры сбора данных показаны в таблице 1.

Таблица 1 Статистика сбора данных Cryo-EM.

Первоначальная реконструкция: кадры 3–40 или 2–20 каждой микрофотографии были скорректированы по движению, взвешены по дозе и объединены с использованием motioncor2 72 .Функция передачи контраста (CTF) для каждой микрофотографии определялась с использованием gCTF 73 на микрофотографиях с коррекцией движения, но без взвешивания по дозе. Частицы были отобраны с использованием Relion3 auttopicking 74 с использованием средних классов из предыдущей реконструкции 15 , отфильтрованных до 30 Å в качестве шаблонов поиска. Отдельные частицы были извлечены в коробки размером 280 × 280 пикселей (300 Å 2 ) и отбракованы с помощью нескольких раундов 2D и 3D классификации в Relion3. Полученная стопка частиц, содержащая 208 539 частиц, была использована для создания консенсусной реконструкции.Шаги обработки и промежуточные классы показаны на дополнительном рисунке 10.

Уточнение многотельных: маски были созданы для верхней и нижней половин консенсусной реконструкции (дополнительный рисунок 7a) с использованием инструмента объемного ластика в UCSF Chimera и Relion3 и использованы для многотельного уточнения в Relion3 51 . Анализ главных компонентов выявил 6 компонентных движений, на которые приходилось ~ 85% изменчивости частиц (дополнительная таблица 3, дополнительные фильмы 1–6).Затем частицы были дополнительно подразделены на классы на основе значений основных компонентов 0 и 1. Затем отдельные подклассы использовались для создания трехмерных реконструкций в Relion. Все модели подкласса были независимо реконструированы с использованием модели консенсуса, отфильтрованной до разрешения 60 Å, в качестве исходной модели (дополнительный рис. 7b).

Гибкая подгонка моделей к крио-ЭМ картам: модель была создана на основе записи PDB BamABCDE 5LJO 15 . С-концевые глобулярные домены BamC были усечены, оставив только область лассо 40 (остатки 25–83), в результате была получена исходная модель, содержащая BamA 24–806 , BamB 22–392 , BamC 25– 83 , BamD 26–243 и BamE 24–110 .Исходная модель была вписана в каждую плотность ЭМ как твердое тело с использованием UCSF Chimera 75 и гибко подогнана с помощью гибкого фитинга молекулярной динамики 76 .

Анализ конформаций POTRA: набор скриптов Python был использован для анализа относительных положений доменов POTRA в 16 ЭМ-структурах и доступных структурах BamABCDE 13,14,15 и BamACDE 12,13 из литературы. Структуры были сокращены до общей согласованной последовательности, вычислен центр масс (COM) для всех атомов Cα в каждом POTRA и расстояния между COM, нанесенные на корреляционные матрицы.Домены POTRA были определены как остатки POTRA1 24–92, остатки POTRA2 92–173, остатки POTRA3 173–265, остатки POTRA4 265–347 и остатки POTRA5 350–422. Структуры BAM выравнивались друг относительно друга по-разному в зависимости от того, какой анализ проводился. Для анализа положения POTRA5 структуры были выровнены на задней стороне β-ствола BamA напротив латеральных ворот (остатки 518–767). Для анализа общей формы штопора POTRA и взаимосвязи между POTRA4 и POTRA5, структуры были выровнены на POTRA5.Для анализа дополнительных взаимосвязей POTRA, структуры были выровнены по предыдущему домену POTRA, то есть POTRA4 для анализа POTRA4 – POTRA3, POTRA3 для анализа POTRA3 – POTRA2 и так далее. Все скрипты, используемые для нормализации последовательности, выравнивания, вычисления COM и преобразования относительного положения POTRA, доступны по адресу https://github.com/attamatti/movement_analysis и https://github.com/attamatti/COM_analysis.

Сравнение карт BAM детергента и нанодиска: модели комплекса BAM, солюбилизированного детергентом, PDB 5LJO 15 и согласованной структуры BAM-нанодиска, были помещены в соответствующие карты (EMDB-4061 15 и согласованная карта соответственно) в UCSF Chimera 75 .Были выбраны все плотности в пределах 4 Å от подобранных структур, а оставшаяся плотность вычтена, чтобы удалить плотность мицеллы или нанодиска. Вычтенные карты были выровнены в Chimera, а общая кросс-корреляция, рассчитанная с помощью Chimera и FSC, между выровненными картами была рассчитана с использованием relion_image_handler 74 .

Подгонка структур MSP к карте BAM нанодисков: Для анализов на дополнительных рисунках. 5 и 15 модель нанодиска MSP1D1 была создана с использованием CHARMM-GUI 77,78 , липиды удалены, и MSP вручную подогнаны под плотность EM.Следует отметить, что общая ориентация двух MSP и местоположения концов относительно BAM и друг друга является наилучшим предположением, основанным на плотности. Затем модель MSP была гибко подогнана с помощью MDFF 76 .

МД-моделирование

Настройка и запуск МД-моделирования: МД-моделирование всего атома за 1 мкс было выполнено в явном растворителе с использованием GROMACS 2016.4 79 и силового поля CHARMM36 80 . Системы моделирования были созданы с помощью CHARMM-GUI 77,78 и использовали генератор входных данных Nanodisc Builder 78 .Нанодиски MSP1D1 в каждой системе содержали три различных типа липидов: 1-пальмитоил (16: 0) -2-ваценоил (18: 1 цис -11) -фосфатидилэтаноламин (PVPE), 1-пальмитоил (16: 0) -2. -ваценоил (18: 1 цис -11) -фосфатидилглицерин (PVPG) и 1,1′-пальмитоил-2,2′-ваценоил кардиолипин с чистым зарядом -2 e (PVCL2). Молярное соотношение составляло ~ 70: 25: 5 ПВПЭ: ПВПГ: ПВКЛ, чтобы приблизиться к составу полярного липидного экстракта E. coli , используемого в эксперименте. При моделировании BAM на нанодиске MSP1D1 в качестве начальной структуры использовался комплекс BamABCDE (PDB: 5LJO 15 ) с отсутствующими N- и C-концевыми остатками, встроенными в Chimera 75 .Липидирование N-концевых остатков Cys BamB-E проводили в CHARMM-GUI 77 . Для моделирования β-бочкообразного домена OmpA (tOmpA) исходная структура была взята из PDB: 1QJP 47 , с замененными мутантными остатками в структуре остатками дикого типа и отсутствующими остатками в петлях, встроенными с помощью MODELLER. 81 . Полная информация о молекулярном содержании каждого моделирования приведена в дополнительной таблице 2.

Системы были минимизированы (5000 шагов) с ограничениями положения белковой цепи, боковой цепи белка и липидов 400, 40 и 1000 кДж моль -1 нм — 2 , соответственно, с последующим уравновешиванием в общей сложности 375 пс, в течение которого эти ограничения были постепенно сняты.В моделировании комплекса BAM был выполнен дополнительный этап уравновешивания продолжительностью 30 нс, чтобы позволить хвостам ацильной цепи липопротеинов BamB-E уравновеситься в бислое нанодисков. Во время этого этапа ограничение положения 1000 кДж моль -1 нм -2 было применено к белковой цепи BamA-E. Функция переключения силы использовалась для плавного выключения ван-дер-ваальсовых взаимодействий между 1,0 и 1,2 нм 82 , а метод Эвальда из частиц и сетки использовался для расчета электростатических взаимодействий на большие расстояния 83 .Во всех системах давление поддерживалось с помощью баростата Парринелло – Рахмана 84 , а температура поддерживалась с помощью термостата Носа – Гувера 85 . Давление и температура в системах составляли 1 бар и 303,15 К соответственно, временной шаг — 2 фс.

Анализ толщины мембраны и планарности MSP в МД-моделировании: координаты белков и липидных атомов извлекались через каждые 100 кадров МД-моделирования с использованием команды GROMACs ‘ gmx trjconv’ , что давало 250 отдельных структур для каждой симуляции.Была написана серия скриптов на Python для анализа толщины мембраны и планарности нанодисков для каждого кадра отдельно, а полученные данные были скомпилированы. Для определения толщины мембраны атом фосфата в каждом липиде использовался для определения его положения. Плоскость соответствовала всем атомам фосфата, и каждый липид был назначен либо на верхнюю, либо на нижнюю створку, в зависимости от его положения относительно этой плоскости. Затем индивидуальные плоскости были подогнаны к каждой из створок, и их среднее значение использовалось для определения более точной центральной плоскости.Затем координаты каждого атома фосфата проецировались на среднюю центральную плоскость, а абсолютное расстояние между фосфатом и его проекцией на центральную плоскость использовалось для определения его высоты. Площадь внутри нанодиска в центральной плоскости отбиралась на сетке 1 × 1 Å, а высота любой заданной точки на сетке рассчитывалась как средняя высота трех ближайших липидных головных групп. Этот расчет проводился отдельно для верхней и нижней створок, а сумма использовалась для определения толщины бислоя в данной точке.Средняя толщина бислоя и стандартные отклонения указаны для всех 250 структур.

Для планарности MSP был проведен аналогичный, но отдельный анализ. Верхний и нижний MSP анализировались отдельно. Для каждого из них была подобрана плоскость для атомов Cα белка MSP и координаты каждого Cα ( x , y , z ), спроецированные на плоскость ( x p , y p , z p ).2}}} \ right). $$

Все анализы и подгонка были выполнены с использованием numpy 86 и scipy 87 . Скрипты, используемые для этого анализа, доступны по адресу https://github.com/attamatti/nanodisc_lipid_analysis.

smFRET эксперименты

Приготовление меченого БАМ: растворы, содержащие краситель, все время защищали от света, чтобы уменьшить фотообесцвечивание. Всего 1 мг лиофилизированных красителей малеимида Alexa Fluor 488 и малеимида DyLight 594 восстанавливали в ДМСО до исходной концентрации 10 мМ.Около 200 мкл ~ 95 мкМ БАМ (R127C / N520C / C690S / C700S) заменяли буфером с использованием 0,5-мл колонки для обессоливания ZebaSpin 7k MWCO в восстанавливающий буфер для мечения (10 мМ DTT, 0,05% (мас. / Об.) DDM, 1 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl и 50 мМ Трис-HCl, pH 7,6) и дали возможность восстановиться в течение 45 минут при 4 ° C. Затем образец заменяли буфером для мечения, продуваемым азотом (как указано выше, но без восстановителя). Молярный избыток каждого красителя над БАМ варьировали до тех пор, пока не было достигнуто мечение БАМ каждым красителем в соотношении 50:50; наилучшие условия оказались равными ~ 1.75-кратный молярный избыток Alexa Fluor 488 и ~ 8,8-кратный молярный избыток DyLight 594. Красители были предварительно смешаны и добавлены в БАМ (R127C / N520C / C690S / C700S), по 10 мкл за раз, в быстрой последовательности , при перемешивании. После добавления полного количества красителя образец помещали на валик и оставляли реагировать при комнатной температуре (~ 23 ° C) в течение 1 часа. Эту реакцию гасили 100-кратным молярным избытком DTT над красителями. Затем объем доводили буфером для мечения до 200 мкл перед удалением свободного красителя с использованием колонки Superdex 200 10/30 GL, предварительно уравновешенной рабочим буфером (0.05% (мас. / Об.) DDM, 150 мМ NaCl и 20 мМ Трис-HCl, pH 8,0). Разделение проводили при 0,5 мл мин -1 с постоянным контролем при 280, 495 и 590 нм. Всего 0,5 мл фракции, соответствующие белку с двойной меткой, были объединены и сконцентрированы до ~ 500 мкл в центробежном концентраторе MWCO VivaSpin 20 с молекулярной массой 50 кДа. Концентрацию белка и стехиометрию мечения определяли с помощью УФ-спектроскопии (NanoDrop 2000) с поправками A 280 для вычитания дополнительного поглощения при 280 нм из самих красителей.Это дало стехиометрию 0,48 для Alexa Fluor 488, 0,52 для DyLight 594. Всего аликвоты объемом 3 мкл были мгновенно заморожены в жидком азоте и хранили при -80 ° C.

Эксперименты с smFRET: smFRET проводился с использованием специально созданной установки для возбуждения переменного лазерного излучения в мкс 88 . Используемые длины волн и мощность лазера составляли 488 нм, 140 мкВт и 594 нм, 120 мкВт. Период смены лазера составлял 40 мкс (скважность 40%). Образцы меченого БАМ на нанодисках MSP1D1 были приготовлены в день использования из концентрированных запасов (см. Выше) и хранились на льду в темноте, пока не использовались.Все измерения проводились при комнатной температуре (~ 23 ° C), той же температуре, при которой были изготовлены криоЭМ сетки. Образец меченого БАМ (100 мкл, 20 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 20 пМ) добавляли поверх покровного стекла, установленного на объектив. Для контроля расстояния фокальной плоскости от покровного стекла использовалась камера, а высота объектива регулировалась с помощью пьезоконтроллера (Piezosystem Jena) до 20 мкм над поверхностью покровного стекла. Сбор данных выполняли в 3 × 10-минутных циклах со свежим образцом, подготовленным после каждого третьего сбора, для контроля агрегации белка, прилипания к покровному стеклу и изменений осмолярности от испарения.Испарение было дополнительно минимизировано за счет использования крышки для покровного стекла. Данные были собраны с использованием графической среды LabVIEW (LabVIEW 7.1 Professional Development System для Windows, National Instruments, Остин, Техас) 89 . Затем отдельные потоки фотонов были преобразованы и сохранены в формате открытого файла для экспериментов по флуоресценции одиночных молекул на основе временных меток (Photon-HDF5), которые совместимы со многими современными средами обработки данных 90 . Данные каждого 10-минутного сбора данных были объединены перед последующим анализом.Всплески флуоресценции были проанализированы с использованием пользовательских скриптов Python 2.7 91 и с использованием FRETBursts, набора инструментов с открытым исходным кодом для анализа свободно распространяющихся всплесков smFRET 92 . Функции из пакета FRETBursts использовались для оценки фонового сигнала как функции времени, выявления и удаления артефактов из-за фотофизических эффектов, таких как мигание, и обеспечения оптимального отношения сигнал / шум. Для получения всплесков начальный нижний порог был установлен на уровне 20 фотонов на всплеск.Были применены три корректирующих параметра, как описано ранее 91 : γ-фактор (для учета различий в эффективности возбуждения каждого красителя), утечка донора в канал акцептора и прямое возбуждение акцептора лазером возбуждения донора. Чтобы удалить всплески, возникающие от белков с одной меткой, данные всплесков фильтровали с использованием ALEX-2CDE, получая всплески с гауссовым распределением значений S в узком диапазоне стехиометрии красителя (S в пределах 0,25–0,75) 93 .Затем был применен последний нижний пороговый фильтр из трех фотонов в акцепторном канале во время возбуждения донора. Всего после применения всех фильтров было собрано 8582 пакета. Отфильтрованные пакеты затем анализировались повторным анализом 52 , выполняемым с использованием ранее описанных скриптов Python (2.7 или 3.7) 91 . Вкратце, повторный анализ использует чрезвычайно разбавленные образцы, где вероятность того, что молекула вернется в конфокальный объем в течение короткого временного окна, больше, чем вероятность обнаружения новой молекулы.Максимально возможное время повторения связано с концентрацией и временем распространения наблюдаемых объектов и может быть установлено на основе вероятности повторения. Вероятность повторения одиночных молекул оценивалась корреляционным методом 49 . Ожидается, что всплески от разных и невзаимодействующих молекул будут некоррелированными, тогда как всплески, исходящие от одной и той же молекулы, должны быть коррелированы, и можно рассчитать вероятность повторения одной и той же молекулы P тот же ( t ):

$$ P _ {\ rm {same}} \ left (t \ right) = 1 — 1 / g \ left (t \ right), $$

, где g ( t ) — автокорреляция времени всплеска функция всех обнаруженных всплесков.Из подбора данных мы определили для каждой пары всплесков вероятность того, что они произошли от одной и той же повторяющейся молекулы, и вычислили среднее значение P тот же для подмножества всплесков путем усреднения по всем соответствующим парам всплесков. Пары пакетов были нанесены на график и подогнаны к 2D Kernel Density Estimator 94 с полосой пропускания 0,012 с использованием пакетов Seaborn и Matplotlib 95 . Визуализации доступных объемов для красителей FRET, прикрепленных в положениях R127 и N520 BamA, были созданы с использованием программного обеспечения FRET Positioning and Screening (FPS) с параметрами длины линкера красителя и радиуса, как предложено в руководстве FPS для используемых красителей FRET 53 .Прогнозируемые средние значения E FRET для каждой из 16 структур, полученных из крио-ЭМ, были рассчитаны с использованием R 0 60 Å из распределений расстояний между метками, созданных с помощью подключаемого модуля PyMOL MtsslWizard 54 и подобранного к одиночным гауссовым распределениям для сравнения с экспериментально измеренными значениями (дополнительная таблица 5).

Статистика и воспроизводимость

Данные smFRET были собраны с использованием однократной подготовки нанодисков.Каждый образец был разбавлен непосредственно перед измерением и проанализирован в трех экземплярах, всего 30 циклов и 10 отдельных препаративных разведений. Объект данных, содержащий все восстановленные всплески, содержащие более 30 фотонов ( N = 29,553), был подвергнут уточнению, как подробно описано в разделе «Методы», в результате чего после удаления всех ложных всплесков получилось N = 8582.

Анализы активности на основе флуоресценции проводили в трех повторностях. Каждая серия данных на рис.2а показано среднее значение из трех повторов с минимальным и максимальным значением для точки данных.

Анализ контактов упаковки кристалла

Рентгеновские кристаллические структуры BamABCDE с закрытым боковым затвором (PDB: 5D0O 13 и 5AYW 14 ) практически идентичны (Cα RMSD 1,88 Å по всей структуре) и имеют одинаковые размеры элементарной ячейки и кристаллографическая симметрия, но кристаллическая упаковка этих двух структур различается. Кроме того, асимметричный блок 5D0Q 13 содержит две копии BamACDE с разными структурами и кристаллическими контактами.Они были проанализированы отдельно. Область элементарной ячейки 3 × 3 вокруг каждой структуры была создана с использованием химеры UCSF, и все атомы с перекрытием радиуса Ван-дер-Ваальса более 0,4 Å были идентифицированы как потенциальные контакты. Затем сценарии Python использовались для анализа списков перекрытий для выявления потенциальных солевых мостиков, определенных как амиды боковой цепи Lys / Arg, контактирующие с карбоновыми кислотами боковой цепи Asp / Glu, и потенциальных гидрофобных взаимодействий, определяемых как атомы углерода с указанным выше> 0,4 ​​Å van der Перекрытие радиусов Ваальса.Водородные связи были идентифицированы с использованием функции «findHbonds» UCSF Chimera с использованием параметров по умолчанию. Скрипты, используемые для анализа упаковки кристаллов, доступны по адресу https://githib.com/attamati/crystal_packing_analysis.

Краткое изложение отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета по исследованию природы, связанном с этой статьей.

Музыкальные инструменты 2.2-миллиметровый провод медной гитары Fretwire Gauge fretwire, пригодный для электрогитары Vbest life 24PCS Fret Wire Set Детали для электрогитары

2.2 мм провод медная гитара Fretwire Gauge fretwire подходит для электрогитары Vbest life 24PCS Fret Wire Set

Стальной барабан для языка 11 Notes 10 дюймов, Стальной барабан для языка с красивой отделкой и спокойным звуком с мягкой сумкой для барабана и парой молотков. Управляемые характеристиками входы / выходы, позиционирование по полюсу или клину и встроенный 2-канальный микшер Alto Professional TS310 10-дюймовый 2-полосный активный громкоговоритель мощностью 2000 Вт со встроенными элементами управления контуром. Черная лампочка 75w / 120v, 4×16.4FT 65.6ft / 20M Светодиодные полосы Светодиодные фонари Синхронизация музыки, 5050 RGB Изменение цвета светодиодной полосы, Smart App Controlled, Контроллер Bluetooth, Удаленный набор светодиодных лент для домашней вечеринки в спальне, Natural с Табачные кольца PDP Concept Maple Classic Mounted Tom.Адаптер переменного тока работает от источника питания. Совместим с CASIO PX-130 Privia. Шнур питания для клавиатуры цифрового пианино. Блок питания, складная подставка для штатива MagiDeal Mini. Подставка для духового инструмента для кларнета и флейты. черный CoolDi Компактная сустейн-педаль для портативных клавиатур. Индонезия Многоцветный 12-дюймовый барабан Джембе с рисунком кожи зебры ручной работы, Черный Кларнет Milisten Настраиваемая трубка Кларнет Ствол Двухсекционная трубка E Плоский кларнет Детали Аксессуары 50 мм. 30-дюймовая акустическая гитара First Act Discovery, зеленый камуфляж. Seagull 041886 Entourage Folk Burnt Umber QIT Акустико-электрический комплект с Gig Ba.Remo RT-0006-58 6 Красный настраиваемый пэд с пластиной для барабана Ambassador Ebony, футляры и сумки Ashbury Стандартная сумка с мягкой подкладкой для флейты, черный Delavan 47749 Стеллаж для хранения сопел горелки. Кларнет, 17-клавишный кларнет Muslady, деревянные духовые инструменты Bb Flat из АБС-пластика с футляром для переноски Ткань для чистки Мини-отвертка Рид Футляр 10шт. Timiy Пакет из 6 компенсированных седел для электрогитары для комплекта замены TL Style Silver. Комплект обновления JJ Tube для Marshall JMP и JCM800 100 Вт Amps EL34 / ECC83S. Крышка усилителя Fender Acoustic 100, барабан Tycoon Percussion Frame TPTB-6WDB.

Проволока для лада для гитары с проводом 2,2 мм, подходящая для электрогитары Vbest life 24PCS, набор проводов для лада

Vbest life 24PCS, набор проводов для ладов, проволока 2,2 мм, медная гитара, измерительная проволока для ладов, подходит для электрогитары: спорт и отдых. Vbest life 24PCS Fret Wire Set, провод 2,2 мм для медной гитары Fretwire Gauge fretwire, подходящий для электрогитары: Спорт и туризм. ♫ 【VIP-СЕРВИС】 Если вы не удовлетворены полученным товаром, вы можете отправить нам письмо по электронной почте в любое время.Мы немедленно ответим вам и поможем решить вашу проблему。 ♫ 【ИДЕАЛЬНАЯ ЗАМЕНА】 Это полезный аксессуар и подарок для любителей гитары。 ♫ 【ХОРОШАЯ ОТДЕЛКА】 Тонкая обработка обеспечивает гладкую поверхность и кромку коронки лада, не повредит гриф и струны。 ♫ 【СОДЕРЖИМОЕ УПАКОВКИ】 Поставляется с 24 шт., достаточно для замены всех ладов на вашей гитаре。 ♫ 【МАТЕРИАЛ】 Ладовой провод изготовлен из качественной меди, высокопрочный и долговечный。 Особенности: Этот предмет сделан из качественной меди, высокая прочность и долговечность.Тонкая обработка обеспечивает гладкую поверхность и кромку короны лада, не повреждает гриф и струны. Легко устанавливать и снимать. For 2 шт. В продаже, достаточно для замены всех ладов на вашей гитаре. Полезный аксессуар для любителей гитары.。 Спецификация: Материал: медь。 Цвет: как на картинке。 Количество: 2 шт.。 Ширина: прибл. 2,2 мм / 0,07 дюйма。 Вес: прибл. 2g。。 Комплектация: 2 провода для лада







Upcycling: Cider Barrel Guitar Fingerstyle No 3 Back, Sides Oak, Top Spruce — Кувшин для сидра с инкрустацией

Сырье

Древесина

Мы уже давно работаем с местными лесами.Нас вдохновил конкурс Local Wood Challenge, который побуждает мастеров переосмыслить и открыть для себя местный лес для изготовления гитар.

К нашему 35-летнему юбилею мы хотели подарить что-то особенное. Так родилась идея с бочкой для сидра. Таким образом мы также экономим ресурсы. Помимо веселья, этот проект имел еще и большой успех!

Гитара имеет спинку и бока из дуба этой бочки. В некоторых местах древесина визуально раскрывает свое происхождение и поэтому имеет особый шарм.Вершина 50-летней давности сделана из ели с горы Гессен Фельдберг. Мы выбрали набор с впечатляющей текстурой, чтобы вписаться в необычную спину и боковые стороны, а также в особую концепцию этой гитары.

Гриф этой гитары фингерпринта сделан из ольхи, накладки на гриф, бридж, крепления, хвостовой клин, а на грифе из местной сливы и розетки из клена.

Оборудование

Что касается формы корпуса, мы выбрали гитару в стиле фингерпринта с длиной шкалы 630 мм и переходом гриф-корпус на 12-м ладу.Наш фирменный испанский гриф, легкий, сбалансированный дизайн, куполообразный верх, конечно же, нельзя не заметить на этой модели. Распорка была специально адаптирована к особенностям дуба. Важной отличительной чертой грифа является типичный кувшин для гессенского сидра на 11-13 ладах.

Головки машины Schaller Grand Tune завершают образ. Струны, как обычно, от Elixir. Для этого изделия мы выбрали футляр от Artur Benedykt.

Разъединенная бочка для сидра

Обработка и звук

В то время как многим гитарам нужно время, чтобы развить свое музыкальное мастерство, как и все наши модели, эта гитара стоит на своем месте с самого первого дня.Форма грифа, ширина порожка и положение струны оптимизированы для сложных манипуляций. Особенно важно чистое разделение звука для поддержки техники стиля пальцев.

Частотный спектр дуба в сочетании с верхом из ели дает звук, которого мы не ожидали. Глубокие басы, выразительные низкие средние и серебристые, мерцающие высокие напоминают «классическую» комбинацию розового дерева и ели. Таким образом, эта гитара сияет не только типичным тональным балансом STOLL, но и типичной быстрой реакцией.

В личное коллекционирование гитары входит бесплатная дегустация сидра.

Фрустрация и сворачивание белка TIM Barrel

Множественные пути сворачивания обнаружены с помощью моделирования, подтверждены данные SAXS и FRET с разрешением времени.

В своих постоянных попытках понять неправильно сворачивающиеся белки как часть этиологии различных заболеваний, лаборатория Мэтьюза уделяет особое внимание о различных факторах, которые препятствуют выходу белка из развернутого состояния к глобальному минимуму свободной энергии.Сложность складывания траектории по понятным причинам зависит от размера белка в основном из-за образование промежуточных продуктов, многие из которых часто препятствуют образованию оптимальное родное телосложение.

Бочкообразное семейство белков триосфатизомеразы (TIM) очень хорошо характерный и сохраненный путь сворачивания, несмотря на большие вариации в последовательности что делает его идеальной группой белков для получения широко применимых идей. в процесс складывания. Как и другие изученные ранее белки, S.Solfataricus индол-3-глицеринфосфатсинтаза (SsIGPS) бочкообразный белок TIM идет через фазу всплеска, за которой следует фаза расслабления, а затем, в конце концов, складывается в исходное строение. Мутационный и водородный обмен эксперименты помогли охарактеризовать виды, обнаруженные за несколько миллисекунд. временной диапазон процесса складывания. В этом исследовании Halloran et al. использовали комбинацию непрерывного потока FRET, SAXS и моделирования для изучения субмиллисекундное временное окно. SsIGPS имеет 8 βα-повторов, расположенных в виде центральная β-бочка, окруженная α-спиралями.В предыдущих исследованиях это было показано, что он кинетически захватывается в течение первых нескольких миллисекунд путем формирования промежуточный IBP, который характеризуется хорошо защищенным центральным (βα) 4 сегмент. Затем следует расширение защиты на регион, охватывающий (βα) 2-6, который затем распространяется на (βα) 1-8 и, наконец, на естественную складку Достигнут. Доступ к предыдущим экспериментальным системам был ограничен 10 секундами. миллисекунд, что затрудняло понимание фазы всплеска.

В BioCAT измерения равновесного SAXS дали новую структурную информацию относительно исходного и развернутого состояний, которые, как было показано, имеют радиус вращения (Rg) 18 и 46 Å соответственно.К тому же хаотичный поток микрофлюидный смеситель использовался для получения данных SAXS с временным разрешением. Десятикратный разведение SsIGPS в 8 M мочевины с использованием миксера привело к образованию IBP состояние хорошо в пределах мертвого времени смесителя 150 мкс и имеет Rg ~ 26 Å. В то время как график Кратки предполагал, что IBP является шаровидным, кривая P (r) указывает на то, что все еще существуют неструктурированные регионы, и это значительно отличается по сравнению с родным телосложением. CF-FRET, используя более локализованный расстояния для мониторинга конформационных изменений, дополнительно подтвердили формирование IBP во время фазы всплеска еще до первых 50 мкс.Эти наблюдения были подкреплены выводами, сделанными на основе крупнозернистых моделирования, которые показали несколько траекторий, достигающих промежуточных звеньев в которых были разные комбинации родных и неместных регионов. Это было также показали, что не все траектории имеют равную вероятность достижения родное состояние. Однако экспериментальные данные были замечательно согласованы с наблюдения, сделанные во время моделирования, и оба подхода сильно поддержали и дополнительно прояснили модели, взятые из экспериментов по водородному обмену.

См .: Кевин Халлоран, Янмин Ван, Карунеш Арора, Шринивас Чакраварти, Томас Ирвинг, Осман Билсель, Чарльз Л. Брукс III, К. Роберт Мэтьюз. «Нарушение и сворачивание бочкообразного белка TIM», Proc Natl Acad Sci U S. A. 2019. 116 (33): 16378-16383

G2410TG Streamliner ™ с полым корпусом, одинарная резка с фурнитурой Bigsby® и Gold, гриф Laurel, одинарный ствол

Большой, смелый и праведный, G2410TG Streamliner ™ с полым корпусом Single-Cut с Bigsby® и золотой фурнитурой разработан для современного гитариста, который жаждет чего-то сверх нормы.Командная гитара для сильных музыкантов, современная акустика G2410TG , более тонкий корпус из клена, обновленная электроника и подлинно элегантный стиль создают последнюю версию That Great Gretsch® Sound! ™

Секрет звука Streamliner — это новое предложение от Gretsch — хамбакер Broad’Tron ™ BT-2S. Разработанный специально для Streamliner Collection, звукосниматель Broad’Tron с высокой выходной мощностью обеспечивает улучшенную четкость с более плотными басами, надежными низами, чистыми высокими частотами и хриплыми средними частотами.Эта звуковая мощь используется и формируется традиционной схемой управления — регуляторами громкости звукоснимателя грифа и бриджа, регулятором общего тембра, регулятором общего уровня громкости и трехпозиционным переключением звукоснимателей.

Быстро играющий гриф из лаврового дерева с радиусом 12 дюймов и элегантными перламутровыми вставками Hump Block и 22 средними джамбо-ладами на грифе нато с белой окантовкой и тонким U-образным профилем — идеально подходит для работы с аккордами или стрельбы из хот-родов риффы. Добавьте мерцания и выразительности своей игре с лицензированным Bigsby вибрато-диффузором B60, а бридж Adjusto-Matic ™ с закрепленной лавровой основой и синтетической костяной гайкой обеспечивает потрясающую стабильность настройки.

Здесь представлен весь классический броский стиль, который вы привыкли ожидать от Gretsch — черные ручки управления в винтажном стиле, увеличенные F-отверстия для усиления акустической проекции, элегантный состаренный белый переплет с улучшенной отделкой и блестящей золотой фурнитурой.

Модель G2410TG теперь доступна в трех невероятных новых вариантах отделки, включая Ocean Turquoise, Single Barrel Stain и Village Amber. Ocean Turquoise и Village Amber имеют накладку в виде черепахи, а отделка Single Barrel Stain имеет накладку кремового цвета.

  • Совершенно новые звукосниматели Broad’Tron ™ BT-2S
  • Полностью полый, более тонкий корпус из клена 2,25 дюйма с одним вырезом и изогнутой верхней частью для богатой полноты, глубокого резонанса и «звука большого тела»
  • Увеличенные отверстия F для усиления акустической проекции
  • Шея НАТО
  • Лавровая накладка с радиусом 12 дюймов, 22 лада среднего размера и вставки из перламутрового блока Hump Block
  • Общая громкость, основной тон, отдельные регуляторы громкости звукоснимателя и трехпозиционный тумблер звукоснимателя обеспечивают полную гибкость формирования звука
  • Патрубок вибрато B60, лицензированный Bigsby®
  • Мост Adjusto-Matic ™ с закрепленным лавровым основанием
  • Однослойный крем (только для однотонных пятен) или трехслойная накладка под черепаху
  • Черные ручки управления в винтажном стиле и золотая фурнитура
  • Доступен в цветах Ocean Turquoise, Single Barrel Stain и Village Amber

Видео